Les métabolites immunomodulateurs constituent une caractéristique essentielle du microenvironnement tumoral (MET), mais, à quelques exceptions près, leur identité demeure largement inconnue. Dans cette étude, nous avons analysé les tumeurs et les lymphocytes T issus des tumeurs et de l'ascite de patientes atteintes d'un carcinome séreux de haut grade (CSHG) afin de caractériser le métabolome de ces différents compartiments du MET. L'ascite et les cellules tumorales présentent d'importantes différences métaboliques. Comparées à l'ascite, les cellules T infiltrant la tumeur sont significativement enrichies en 1-méthylnicotinamide (MNA). Bien que le taux de MNA soit élevé dans les lymphocytes T, l'expression de la nicotinamide N-méthyltransférase (une enzyme catalysant le transfert de groupes méthyle de la S-adénosylméthionine à la nicotinamide) est limitée aux fibroblastes et aux cellules tumorales. Sur le plan fonctionnel, le MNA induit la sécrétion, par les lymphocytes T, du facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α), une cytokine pro-tumorale. Par conséquent, les MNA dérivés du TME contribuent à la régulation immunitaire des lymphocytes T et représentent une cible potentielle d'immunothérapie pour le traitement du cancer humain.
Les métabolites dérivés des tumeurs peuvent exercer un puissant effet inhibiteur sur l'immunité antitumorale, et de plus en plus de données indiquent qu'ils peuvent également jouer un rôle déterminant dans la progression de la maladie (1). Outre l'effet Warburg, des travaux récents ont commencé à caractériser l'état métabolique des cellules tumorales et sa relation avec l'état immunitaire du microenvironnement tumoral (MET). Des études sur des modèles murins et des lymphocytes T humains ont montré que le métabolisme de la glutamine (2), le métabolisme oxydatif (3) et le métabolisme du glucose (4) peuvent agir indépendamment sur différents sous-groupes de cellules immunitaires. Plusieurs métabolites de ces voies métaboliques inhibent la fonction antitumorale des lymphocytes T. Il a été démontré que le blocage de la coenzyme tétrahydrobioptérine (BH4) peut altérer la prolifération des lymphocytes T, et que l'augmentation de la concentration de BH4 dans l'organisme peut renforcer la réponse immunitaire antitumorale médiée par les CD4 et CD8. De plus, l'effet immunosuppresseur de la kynurénine peut être contré par l'administration de BH4 (5). Dans les glioblastomes porteurs de la mutation de l'isocitrate déshydrogénase (IDH), la sécrétion d'énantiomère métabolite (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) inhibe l'activation, la prolifération et l'activité cytolytique des lymphocytes T (6). Récemment, il a été démontré que le méthylglyoxal, un sous-produit de la glycolyse, est produit par les cellules suppressives d'origine myéloïde et que son transfert par les lymphocytes T peut inhiber la fonction des lymphocytes T effecteurs. En traitement, la neutralisation du méthylglyoxal permet de contrer l'activité des cellules suppressives d'origine myéloïde (MDSC) et de potentialiser l'effet des immunothérapies par blocage des points de contrôle immunitaire chez la souris (7). L'ensemble de ces études souligne le rôle clé des métabolites issus du microenvironnement tumoral dans la régulation de la fonction et de l'activité des lymphocytes T.
Un dysfonctionnement des lymphocytes T a été largement rapporté dans le cancer de l'ovaire (8). Ceci est en partie dû aux caractéristiques métaboliques inhérentes à l'hypoxie et à la vascularisation tumorale anormale (9), entraînant la conversion du glucose et du tryptophane en métabolites tels que l'acide lactique et la kynurénine. Un excès de lactate extracellulaire réduit la production d'interféron-γ (IFN-γ) et favorise la différenciation de sous-groupes myélosuppresseurs (10, 11). La consommation de tryptophane inhibe directement la prolifération des lymphocytes T et la signalisation de leur récepteur (12-14). Malgré ces observations, de nombreux travaux sur le métabolisme immunitaire ont été menés in vitro sur des cultures de lymphocytes T utilisant des milieux optimisés, ou se sont limités à des modèles murins homologues in vivo. Or, aucun de ces modèles ne reflète pleinement l'hétérogénéité des cancers humains ni le macro- et microenvironnement physiologique.
Le cancer de l'ovaire se caractérise souvent par une dissémination péritonéale et l'apparition d'une ascite. L'accumulation de liquide péritonéal dans l'ascite est associée à une maladie avancée et à un mauvais pronostic (15). Selon certaines études, ce compartiment particulier est hypoxique, présente des taux élevés de facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) et d'indoleamine 2,3-dioxygénase (IDO), et est infiltré par des lymphocytes T régulateurs et des cellules myéloïdes inhibitrices (15-18). Le métabolisme de l'ascite pouvant différer de celui de la tumeur elle-même, la reprogrammation des lymphocytes T dans l'espace péritonéal reste mal comprise. De plus, les différences et l'hétérogénéité importantes entre l'ascite et les métabolites présents dans le microenvironnement tumoral pourraient entraver l'infiltration des cellules immunitaires et leur action sur les tumeurs ; des recherches supplémentaires sont donc nécessaires.
Afin de résoudre ces problèmes, nous avons conçu une méthode sensible de séparation cellulaire et de spectrométrie de masse en tandem couplée à la chromatographie liquide (LC-MS/MS) pour étudier différents types cellulaires (notamment les lymphocytes T CD4+ et CD8+) au sein et entre les tumeurs. Ses métabolites sont présents dans les cellules de l'ascite et du microenvironnement tumoral du patient. Nous utilisons cette méthode conjointement à la cytométrie de flux à haute dimensionnalité et au séquençage d'ARN unicellulaire (scRNA-seq) pour obtenir une description très précise du statut métabolique de ces populations clés. Cette méthode a révélé une augmentation significative du taux de 1-méthylnicotinamide (MNA) dans les lymphocytes T tumoraux, et des expériences in vitro ont montré que l'effet immunomodulateur du MNA sur la fonction des lymphocytes T était jusqu'alors inconnu. De manière générale, cette méthode révèle les interactions métaboliques réciproques entre les tumeurs et les cellules immunitaires, et apporte des informations uniques sur les métabolites impliqués dans la régulation immunitaire, ce qui pourrait s'avérer utile pour l'immunothérapie du cancer de l'ovaire à base de lymphocytes T.
Nous avons utilisé la cytométrie de flux à haute dimensionnalité pour quantifier simultanément l'absorption de glucose [2-(N-(7-nitrophényl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-désoxyglucose (2-NBDG)] et l'activité mitochondriale [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20), marqueurs typiques permettant de distinguer les cellules immunitaires et les populations de cellules tumorales (Tableau S2 et Figure S1A). Cette analyse a montré que, comparativement aux lymphocytes T, les cellules d'ascite et les cellules tumorales présentent des niveaux d'absorption de glucose plus élevés, mais des différences plus faibles d'activité mitochondriale. L'absorption moyenne de glucose par les cellules tumorales [CD45-EpCAM (EpCAM)+] est trois à quatre fois supérieure à celle des lymphocytes T, et celle des lymphocytes T CD4+ est 1,2 fois supérieure à celle des lymphocytes T CD8+, ce qui indique que les lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL) ont des besoins métaboliques différents, même au sein d'un même microenvironnement tumoral (Figure 1A). En revanche, l'activité mitochondriale des cellules tumorales est similaire à celle des lymphocytes T CD4+, et supérieure à celle des lymphocytes T CD8+ (Figure 1B). Ces résultats reflètent globalement le niveau métabolique. L'activité métabolique des cellules tumorales est supérieure à celle des lymphocytes T CD4+, elle-même supérieure à celle des lymphocytes T CD8+. Malgré ces différences entre les types cellulaires, aucune différence significative n'a été observée concernant le statut métabolique des lymphocytes T CD4+ et CD8+, ni leurs proportions relatives, dans l'ascite par rapport aux tumeurs (Figure 1C). Par contre, dans la fraction cellulaire CD45-, la proportion de cellules EpCAM+ a augmenté dans la tumeur par rapport à l'ascite (Figure 1D). Nous avons également observé une nette différence métabolique entre les composantes cellulaires EpCAM+ et EpCAM-. Les cellules EpCAM+ (tumorales) ont une absorption de glucose et une activité mitochondriale plus élevées que les cellules EpCAM-, ce qui est beaucoup plus élevé que l'activité métabolique des fibroblastes dans les cellules tumorales dans le TME (Figure 1, E et F).
(A et B) Intensité de fluorescence médiane (IFM) de l'absorption de glucose (2-NBDG) (A) et activité mitochondriale des lymphocytes T CD4+ (MitoTracker rouge foncé) (B). Graphiques représentatifs (à gauche) et données tabulées (à droite) : lymphocytes T CD8+ et cellules tumorales EpCAM+CD45- issues de l'ascite et de la tumeur. (C) Rapport entre les cellules CD4+ et CD8+ (parmi les lymphocytes T CD3+) dans l'ascite et la tumeur. (D) Proportion de cellules tumorales EpCAM+ dans l'ascite et la tumeur (CD45−). (E et F) Absorption de glucose (2-NBDG) par les cellules tumorales EpCAM+CD45- et les cellules de la matrice EpCAM-CD45- (E) et activité mitochondriale (MitoTracker rouge foncé) (F) : graphiques représentatifs (à gauche) et données tabulées (à droite) : cellules de l'ascite et de la tumeur. (G) Graphiques représentatifs de l'expression de CD25, CD137 et PD1 par cytométrie en flux. (H et I) Expression de CD25, CD137 et PD1 sur les lymphocytes T CD4+ (H) et CD8+ (I). (J et K) Phénotypes naïfs, mémoires centrales (Tcm), effecteurs (Teff) et mémoires effectrices (Tem) selon l'expression de CCR7 et CD45RO. Images représentatives (à gauche) et données tabulaires (à droite) des lymphocytes T CD4+ (J) et CD8+ (K) dans l'ascite et les tumeurs. Valeurs p déterminées par test t apparié (*p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001). La ligne représente les patients appariés (n = 6). FMO : fluorescence moins un ; MFI : intensité de fluorescence médiane.
Une analyse plus poussée a révélé d'autres différences significatives entre les phénotypes des lymphocytes T, finement résolus. Les lymphocytes T activés (Figure 1, G à I) et les lymphocytes T mémoire effecteurs (Figure 1, J et K) sont beaucoup plus fréquents dans les tumeurs que dans l'ascite (proportion de lymphocytes T CD3+). De même, l'analyse du phénotype par l'expression des marqueurs d'activation (CD25 et CD137) et des marqueurs de déplétion [protéine de mort cellulaire programmée 1 (PD-1)] a montré que, malgré des caractéristiques métaboliques différentes, aucune différence métabolique significative n'a été observée entre les sous-populations naïves, effectrices ou mémoires (Figure S1, F à I). Ces résultats ont été confirmés par l'utilisation de méthodes d'apprentissage automatique pour l'attribution automatique des phénotypes cellulaires (21), ce qui a également révélé la présence d'un grand nombre de cellules de moelle osseuse (CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+) dans l'ascite du patient (Figure S2A). Parmi tous les types cellulaires identifiés, cette population de cellules myéloïdes a présenté la plus forte absorption de glucose et la plus grande activité mitochondriale (Figure S2, B à G). Ces résultats soulignent les importantes différences métaboliques entre les différents types cellulaires présents dans l'ascite et les tumeurs chez les patientes atteintes d'un carcinome séreux de haut grade.
Le principal défi pour comprendre les caractéristiques métabolomiques des TIL réside dans la nécessité d'isoler des échantillons de lymphocytes T d'une pureté, d'une qualité et d'une quantité suffisantes à partir des tumeurs. Des études récentes ont montré que les méthodes de tri et d'enrichissement sur billes, basées sur la cytométrie de flux, peuvent induire des modifications des profils métaboliques cellulaires (22-24). Afin de pallier ce problème, nous avons optimisé la méthode d'enrichissement sur billes pour isoler les TIL à partir de cancers de l'ovaire humains réséqués chirurgicalement, avant analyse par LC-MS/MS (voir Matériel et méthodes ; Figure 2A). Pour évaluer l'impact global de ce protocole sur les modifications métaboliques, nous avons comparé les profils métaboliques de lymphocytes T activés par des donneurs sains après l'étape de séparation sur billes décrite ci-dessus avec ceux de cellules non séparées par billes mais maintenues sur glace. Cette analyse de contrôle qualité a révélé une forte corrélation entre ces deux conditions (r = 0,77), et la répétabilité technique du groupe de 86 métabolites est élevée (Figure 2B). Par conséquent, ces méthodes peuvent effectuer une analyse précise des métabolites dans les cellules subissant un enrichissement de type cellulaire, fournissant ainsi la première plateforme à haute résolution pour identifier des métabolites spécifiques dans le HGSC, permettant ainsi aux personnes d'acquérir une compréhension plus approfondie du programme de métabolisme sexuel spécifique des cellules.
(A) Schéma de principe de l'enrichissement par billes magnétiques. Avant l'analyse par LC-MS/MS, les cellules subissent trois cycles consécutifs d'enrichissement par billes magnétiques ou sont maintenues sur glace. (B) Effet du type d'enrichissement sur l'abondance des métabolites. Moyenne de trois mesures pour chaque type d'enrichissement ± erreur standard. La ligne grise représente une relation 1:1. Le coefficient de corrélation intraclasse (CCI) des mesures répétées est indiqué sur l'axe des abscisses. NAD : nicotinamide adénine dinucléotide. (C) Schéma du protocole d'analyse des métabolites des patients. Des échantillons d'ascite ou de tumeurs sont prélevés chez les patients et cryoconservés. Une petite partie de chaque échantillon est analysée par cytométrie en flux, tandis que le reste subit trois cycles d'enrichissement pour les cellules CD4+, CD8+ et CD45-. Ces fractions cellulaires sont ensuite analysées par LC-MS/MS. (D) Carte thermique de l'abondance standardisée des métabolites. Le dendrogramme représente le regroupement de Ward des distances euclidiennes entre les échantillons. (E) Analyse en composantes principales (ACP) de la carte métabolique des échantillons, montrant trois réplicats de chaque échantillon ; les échantillons provenant d’un même patient sont reliés par un trait. (F) ACP du profil métabolique de l’échantillon conditionné par le patient (c.-à-d. avec redondance partielle) ; le type d’échantillon est limité par l’enveloppe convexe. PC1 : composante principale 1 ; PC2 : composante principale 2.
Nous avons ensuite appliqué cette méthode d'enrichissement à l'analyse de 99 métabolites dans les fractions cellulaires CD4+, CD8+ et CD45- de l'ascite et des tumeurs primaires de six patientes atteintes d'un carcinome séreux de haut grade (figure 2C, figure S3A et tableaux S3 et S4). La population d'intérêt représente de 2 % à 70 % de l'échantillon initial de cellules vivantes, et cette proportion varie considérablement d'une patiente à l'autre. Après séparation des billes, la fraction enrichie (CD4+, CD8+ ou CD45-) représente en moyenne plus de 85 % de toutes les cellules vivantes de l'échantillon. Cette méthode d'enrichissement nous permet d'analyser le métabolisme des populations cellulaires issues de tissus tumoraux humains, ce qui est impossible à réaliser à partir d'échantillons de grande taille. Grâce à ce protocole, nous avons déterminé que la L-kynurénine et l'adénosine, deux métabolites immunosuppresseurs bien caractérisés, étaient surexprimées dans les lymphocytes T tumoraux ou les cellules tumorales (figure S3, B et C). Par conséquent, ces résultats démontrent la fidélité et la capacité de notre technologie de séparation cellulaire et de spectrométrie de masse à identifier des métabolites biologiquement importants dans les tissus des patients.
Notre analyse a également révélé une forte séparation métabolique des types cellulaires, tant au sein d'un même patient qu'entre les patients (figures 2D et S4A). En particulier, comparé aux autres patients, le patient 70 présentait des caractéristiques métaboliques différentes (figures 2E et S4B), suggérant une hétérogénéité métabolique interindividuelle importante. Il est à noter que le volume total d'ascite recueilli chez le patient 70 (80 ml) était inférieur à celui des autres patients (1,2 à 2 litres ; tableau S1). Le contrôle de l'hétérogénéité interindividuelle lors de l'analyse en composantes principales (par exemple, par analyse de redondance partielle) met en évidence des variations cohérentes entre les types cellulaires, et ces derniers, ainsi que le microenvironnement, sont clairement regroupés selon le profil métabolique (figure 2F). L'analyse des métabolites individuels a accentué ces effets et révélé des différences significatives entre les types cellulaires et le microenvironnement. Il convient de souligner que la différence la plus marquée observée concerne le MNA, généralement enrichi dans les cellules CD45- et dans les cellules CD4+ et CD8+ infiltrant la tumeur (figure 3A). Pour les cellules CD4+, cet effet est particulièrement marqué, et le MNA dans les cellules CD8+ semble également fortement influencé par l'environnement. Cependant, ce point est peu pertinent, car seuls trois des six patients ont pu être évalués pour les scores CD8+ tumoraux. Outre le MNA, d'autres métabolites, encore mal caractérisés dans les TIL, présentent également des concentrations différentielles dans différents types cellulaires présents dans l'ascite et les tumeurs (figures S3 et S4). Ces données révèlent donc un ensemble prometteur de métabolites immunomodulateurs qui méritent d'être explorés plus en détail.
(A) Teneur normalisée en MNA dans les cellules CD4+, CD8+ et CD45- de l'ascite et de la tumeur. Le diagramme en boîte représente la médiane (ligne), l'intervalle interquartile (cadre) et l'étendue des données, jusqu'à 1,5 fois l'intervalle interquartile (moustaches). Conformément à la section « Matériel et méthodes », utiliser la valeur limma du patient pour déterminer la valeur P (*P < 0,05 et **P < 0,01). (B) Schéma du métabolisme du MNA (60). Métabolites : S-adénosyl-1-méthionine ; SAH, S-adénosine-1-homocystéine ; NA, nicotinamide ; MNA, 1-méthylnicotinamide ; 2-PY, 1-méthyl-2-pyridone-5-carboxamide ; 4-PY, 1-méthyl-4-pyridone-5-carboxamide ; NR, ribose de nicotinamide ; NMN, mononucléotide de nicotinamide. Enzymes (vert) : NNMT, nicotinamide N-méthyltransférase ; SIRT, sirtuines ; NAMPT, nicotinamide phosphoribosyltransférase ; AOX1, aldéhyde oxydase 1 ; NRK, nicotinamide riboside kinase ; NMNAT, nicotinamide mononucléotide adénylate transférase ; Pnp1, purine nucléoside phosphorylase. (C) t-SNE du scRNA-seq de l’ascite (gris) et de la tumeur (rouge ; n = 3 patients). (D) Expression de NNMT dans différentes populations cellulaires identifiées par scRNA-seq. (E) Expression de NNMT et d’AOX1 dans les cellules SK-OV-3, les cellules rénales embryonnaires humaines (HEK) 293T, les lymphocytes T et les lymphocytes T traités au MNA. L’expression relative est présentée par rapport aux cellules SK-OV-3. Le profil d’expression avec l’erreur standard à la moyenne (SEM) est présenté (n = 6 donneurs sains). Les valeurs Ct supérieures à 35 sont considérées comme indétectables (ID). (F) Expression de SLC22A1 et SLC22A2 dans les cellules SK-OV-3, HEK293T, les lymphocytes T et les lymphocytes T traités avec 8 mM de MNA. L'expression relative est présentée par rapport aux cellules SK-OV-3. Le profil d'expression avec l'erreur standard à la moyenne (SEM) est présenté (n = 6 donneurs sains). Les valeurs Ct supérieures à 35 sont considérées comme indétectables (ID). (G) Teneur en MNA des lymphocytes T activés de donneurs sains après 72 heures d'incubation avec le MNA. Le profil d'expression avec l'erreur standard à la moyenne (SEM) est présenté (n = 4 donneurs sains).
Le MNA est produit par transfert du groupe méthyle de la S-adénosyl-1-méthionine (SAM) à la nicotinamide (NA) par la nicotinamide N-méthyltransférase (NNMT ; Figure 3B). La NNMT est surexprimée dans divers cancers humains et est associée à la prolifération, à l'invasion et aux métastases (25-27). Afin de mieux comprendre l'origine du MNA dans les lymphocytes T du microenvironnement tumoral (TME), nous avons utilisé le séquençage d'ARN unicellulaire (scRNA-seq) pour caractériser l'expression de la NNMT dans différents types cellulaires de l'ascite et des tumeurs de trois patientes atteintes d'un carcinome séreux de haut grade (HGSC) (Tableau S5). L'analyse d'environ 6 500 cellules a montré que, dans l'ascite et la tumeur, l'expression de la NNMT était restreinte aux populations présumées de fibroblastes et de cellules tumorales (Figure 3, C et D). Il est à noter qu'aucune expression évidente de NNMT n'est observée dans les populations exprimant PTPRC (CD45+) (figures 3D et S5A), ce qui indique que le MNA détecté dans le spectre métabolique a été introduit dans les lymphocytes T. L'expression de l'aldéhyde oxydase 1 (AOX1), qui convertit le MNA en 1-méthyl-2-pyridone-5-carboxamide (2-PYR) ou en 1-méthyl-4-pyridone-5-carboxamide (4-PYR) (figure 3B), est également restreinte à la population de fibroblastes exprimant COL1A1 (figure S5A), ce qui suggère que les lymphocytes T sont incapables du métabolisme conventionnel du MNA. Le profil d'expression de ces gènes liés au MNA a été vérifié à l'aide d'un second jeu de données cellulaires indépendant provenant d'ascites de patientes atteintes d'un carcinome séreux de haut grade (figure S5B ; n = 6) (16). De plus, l'analyse par PCR quantitative (qPCR) de lymphocytes T de donneurs sains traités par MNA a montré que, comparativement aux cellules tumorales ovariennes SK-OV-3 témoins, l'expression de NNMT et d'AOX1 était quasi inexistante (Figure 3E). Ces résultats inattendus suggèrent que le MNA pourrait être sécrété par les fibroblastes ou les tumeurs dans les lymphocytes T adjacents au sein du microenvironnement tumoral.
Bien que les candidats incluent la famille des transporteurs de cations organiques 1 à 3 (OCT1, OCT2 et OCT3) codés par la famille des transporteurs solubles 22 (SLC22A1, SLC22A2 et SLC22A3), les transporteurs potentiels de MNA restent encore à identifier (28). La qPCR de l'ARNm extrait de lymphocytes T de donneurs sains a révélé de faibles niveaux d'expression de SLC22A1 et des niveaux indétectables de SLC22A2, confirmant ainsi un résultat précédemment décrit dans la littérature (Figure 3F) (29). En revanche, la lignée cellulaire tumorale ovarienne SK-OV-3 exprime fortement les deux transporteurs (Figure 3F).
Afin d'évaluer la capacité des lymphocytes T à absorber le MNA exogène, des lymphocytes T de donneurs sains ont été cultivés pendant 72 heures en présence de différentes concentrations de MNA. En l'absence de MNA exogène, la concentration cellulaire de MNA est indétectable (Figure 3G). Cependant, les lymphocytes T activés et traités avec du MNA exogène présentent une augmentation dose-dépendante de la concentration intracellulaire de MNA, jusqu'à 6 mM (Figure 3G). Ce résultat indique que, malgré une faible expression du transporteur et l'absence de l'enzyme principale responsable du métabolisme intracellulaire du MNA, les lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL) peuvent absorber le MNA.
Le spectre des métabolites dans les lymphocytes T des patients et les expériences d'absorption de MNA in vitro renforcent l'hypothèse que les fibroblastes associés au cancer (CAF) sécrètent du MNA et que les cellules tumorales pourraient réguler le phénotype et la fonction des TIL. Afin de déterminer l'effet du MNA sur les lymphocytes T, des lymphocytes T de donneurs sains ont été activés in vitro en présence ou en absence de MNA, et leur prolifération et leur production de cytokines ont été évaluées. Après 7 jours d'ajout de MNA à la dose la plus élevée, le nombre de doublements de population était modérément réduit, tandis que la vigueur était maintenue à toutes les doses (Figure 4A). De plus, le traitement par MNA exogène a entraîné une augmentation de la proportion de lymphocytes T CD4+ et CD8+ exprimant le facteur de nécrose tumorale α (TNFα ; Figure 4B). En revanche, la production intracellulaire d'IFN-γ était significativement réduite dans les lymphocytes T CD4+, mais pas dans les lymphocytes T CD8+, et aucune modification significative de l'interleukine 2 (IL-2) n'a été observée (Figure 4C et D). Par conséquent, le dosage immuno-enzymatique (ELISA) des surnageants de ces cultures de lymphocytes T traitées au MNA a révélé une augmentation significative du TNFα, une diminution de l'IFN-γ et aucune modification de l'IL-2 (Figure 4, E à G). La diminution de l'IFN-γ indique que le MNA pourrait inhiber l'activité antitumorale des lymphocytes T. Afin de simuler l'effet du MNA sur la cytotoxicité médiée par les lymphocytes T, des lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (FRα-CAR-T) ciblant le récepteur du folate α et des lymphocytes T CAR (GFP) régulés par la protéine fluorescente verte (GFP-CAR-T) ont été produits à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) de donneurs sains. Les lymphocytes CAR-T ont été cultivés pendant 24 heures en présence de MNA, puis cocultivés avec des cellules tumorales ovariennes humaines SK-OV-3 exprimant le récepteur du folate α, selon un ratio effecteur/cible de 10:1. Le traitement MNA a entraîné une diminution significative de l'activité de destruction des cellules FRα-CAR-T, similaire à celle des cellules FRα-CAR-T traitées à l'adénosine (Figure 4H).
(A) Nombre total de cellules viables et doublement de population (DP) directement à partir de la culture au jour 7. Le graphique à barres représente la moyenne ± l’erreur standard de la moyenne (SEM) de six donneurs sains. Données issues d’au moins n = 3 expériences indépendantes. (B à D) Les CD3/CD28 et l’IL-2 ont été utilisés pour activer les lymphocytes T à leurs concentrations respectives de MNA pendant 7 jours. Avant l’analyse, les cellules ont été stimulées avec du PMA/ionomycine en présence de GolgiStop pendant 4 heures. Expression du TNFα (B) dans les lymphocytes T. Exemple d’image (à gauche) et de données tabulaires (à droite) de l’expression du TNFα dans les cellules vivantes. Expression de l’IFN-γ (C) et de l’IL-2 (D) dans les lymphocytes T. L’expression des cytokines a été mesurée par cytométrie en flux. Le graphique à barres représente la moyenne (n = 6 donneurs sains) ± l’erreur standard de la moyenne (SEM). Une analyse de variance à un facteur (ANOVA) avec mesures répétées (*P < 0,05 et **P < 0,01) a été utilisée pour déterminer la valeur P. Données issues d’au moins n = 3 expériences indépendantes. (E à G) Les lymphocytes T ont été activés par CD3/CD28 et l'IL-2 à leurs concentrations respectives de MNA pendant 7 jours. Le milieu de culture a été recueilli avant et après 4 heures de stimulation par PMA/ionomycine. Les concentrations de TNFα (E), d'IFN-γ (F) et d'IL-2 (G) ont été mesurées par ELISA. Le graphique à barres représente la moyenne (n = 5 donneurs sains) ± l'erreur standard à la moyenne (SEM). La valeur p a été déterminée par une analyse de variance à un facteur (ANOVA) avec mesures répétées (*p < 0,05). La ligne pointillée indique la limite de détection. (H) Test de lyse cellulaire. Les cellules FRα-CAR-T ou GFP-CAR-T ont été traitées avec de l'adénosine (250 μM) ou du MNA (10 mM) pendant 24 heures, ou laissées non traitées (Ctrl). Le pourcentage de cellules SK-OV-3 lysées a été mesuré. La valeur p a été déterminée par le test t de Welch (*p < 0,5 et **p < 0,01).
Afin de mieux comprendre le mécanisme de régulation de l'expression du TNFα par le MNA, les variations de l'ARNm du TNFα dans les lymphocytes T traités au MNA ont été évaluées (Figure 5A). Les lymphocytes T de donneurs sains traités au MNA ont présenté un doublement du niveau de transcription du TNFα, indiquant que le MNA est dépendant de la régulation transcriptionnelle du TNFα. Pour étudier ce mécanisme de régulation potentiel, deux facteurs de transcription connus pour réguler le TNFα, à savoir le facteur nucléaire des lymphocytes T activés (NFAT) et la protéine spécifique 1 (Sp1), ont été évalués en réponse à la liaison du MNA au promoteur proximal du TNFα (30). Le promoteur du TNFα contient six sites de liaison NFAT et deux sites de liaison Sp1 identifiés, se chevauchant à un site [à -55 paires de bases (pb) de la coiffe 5'] (30). L'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) a montré que, suite au traitement par le MNA, la liaison de Sp1 au promoteur du TNFα était multipliée par trois. L'incorporation de NFAT a également augmenté et est devenue significative (Figure 5B). Ces données indiquent que MNA régule l'expression de TNFα via la transcription de Sp1, et dans une moindre mesure celle de NFAT.
(A) Comparaison avec les lymphocytes T cultivés sans MNA, variation d'expression du TNFα dans les lymphocytes T traités au MNA. Le profil d'expression est présenté avec l'erreur standard à la moyenne (SEM) (n = 5 donneurs sains). Données issues d'au moins 3 expériences indépendantes (n = 3). (B) Expression du promoteur du TNFα dans les lymphocytes T traités ou non avec 8 mM de MNA après stimulation par NFAT et Sp1 (contrôle) et par PMA/ionomycine pendant 4 heures. L'immunoglobuline G (IgG) et l'histone H3 ont été utilisées comme contrôles négatif et positif d'immunoprécipitation, respectivement. La quantification par ChIP a montré que la liaison de Sp1 et NFAT au promoteur du TNFα dans les cellules traitées au MNA était plusieurs fois supérieure au contrôle. Données issues d'au moins 3 expériences indépendantes (n = 3). Valeur p déterminée par des tests t multiples (*** p < 0,01). (C) Comparées à l'ascite des carcinomes séreux de haut grade (CSHG), les cellules T (non cytotoxiques) présentaient une expression accrue de TNF dans la tumeur. Les couleurs représentent différentes patientes. Les cellules affichées ont été échantillonnées aléatoirement (300 cellules) et ajustées pour limiter les suréchantillonnages (** Padj = 0,0076). (D) Modèle proposé de l'MNA dans le cancer de l'ovaire. L'MNA est produite par les cellules tumorales et les fibroblastes du microenvironnement tumoral (MET) et est internalisée par les cellules T. L'MNA augmente la liaison de Sp1 au promoteur du TNFα, ce qui induit une augmentation de la transcription et de la production de la cytokine TNFα. L'MNA provoque également une diminution de l'IFN-γ. L'inhibition de la fonction des cellules T entraîne une réduction de leur capacité de destruction et une accélération de la croissance tumorale.
D'après certaines études, le TNFα exerce des effets antitumoraux dépendants de l'avant et de l'arrière, mais son rôle dans la promotion de la croissance et des métastases du cancer de l'ovaire est bien établi (31-33). Il a également été rapporté que la concentration de TNFα dans l'ascite et les tissus tumoraux des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire est supérieure à celle observée dans les tissus bénins (34-36). Sur le plan mécanistique, le TNFα peut réguler l'activation, la fonction et la prolifération des leucocytes, et modifier le phénotype des cellules cancéreuses (37, 38). Conformément à ces observations, l'analyse d'expression génique différentielle a révélé une surexpression significative du TNF dans les lymphocytes T des tissus tumoraux par rapport à l'ascite (Figure 5C). Cette augmentation de l'expression du TNF n'était manifeste que dans les populations de lymphocytes T présentant un phénotype non cytotoxique (Figure S5A). En résumé, ces données confortent l'hypothèse selon laquelle le MNA exerce des effets à la fois immunosuppresseurs et promoteurs de tumeurs dans le carcinome séreux de haut grade.
Le marquage fluorescent par cytométrie en flux est devenu la principale méthode d'étude du métabolisme des TIL. Ces études ont montré que, comparativement aux lymphocytes du sang périphérique ou aux lymphocytes T des organes lymphoïdes secondaires, les TIL murins et humains présentent une plus grande affinité pour le glucose (4, 39) et une perte progressive de fonction mitochondriale (19, 40). Bien que nous ayons observé des résultats similaires dans cette étude, l'avancée majeure réside dans la comparaison du métabolisme des cellules tumorales et des TIL issus du même tissu tumoral réséqué. Conformément à certaines études antérieures, les cellules tumorales (CD45-EpCAM+) de l'ascite et des tumeurs présentent une absorption de glucose supérieure à celle des lymphocytes T CD8+ et CD4+, ce qui confirme que cette forte absorption de glucose par les cellules tumorales peut être comparée à celle des lymphocytes T. Ce phénomène est lié au concept de compétition entre les lymphocytes T et le microenvironnement tumoral (TME). Cependant, l'activité mitochondriale des cellules tumorales est supérieure à celle des lymphocytes T CD8+, mais similaire à celle des lymphocytes T CD4+. Ces résultats confortent l'idée émergente selon laquelle le métabolisme oxydatif est important pour les cellules tumorales (41, 42). Ils suggèrent également que les lymphocytes T CD8+ pourraient être plus sensibles au dysfonctionnement oxydatif que les lymphocytes T CD4+, ou que ces derniers pourraient utiliser des sources de carbone autres que le glucose pour maintenir leur activité mitochondriale (43, 44). Il est à noter que nous n'avons observé aucune différence d'absorption de glucose ni d'activité mitochondriale entre les lymphocytes T effecteurs CD4+, les lymphocytes T mémoire effecteurs et les lymphocytes T mémoire centraux dans l'ascite. De même, l'état de différenciation des lymphocytes T CD8+ dans les tumeurs est indépendant des variations d'absorption de glucose, ce qui souligne la différence significative entre les lymphocytes T cultivés in vitro et les TIL humains in vivo (22). Ces observations ont été confirmées par l'utilisation d'une méthode d'allocation automatique et non biaisée des populations cellulaires, qui a révélé que les cellules CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+, présentant une absorption de glucose et une activité mitochondriale supérieures à celles des cellules tumorales, sont prédominantes au sein d'une population cellulaire métaboliquement active. Cette population pourrait représenter la sous-population putative de cellules myéloïdes suppressives ou de cellules dendritiques plasmacytoïdes identifiée par l'analyse scRNA-seq. Bien que ces deux types cellulaires aient été décrits dans des tumeurs ovariennes humaines [45], des études complémentaires sont nécessaires pour caractériser cette sous-population myéloïde.
Bien que les méthodes basées sur la cytométrie en flux puissent clarifier les différences générales de métabolisme du glucose et d'oxydation entre les types cellulaires, les métabolites précis produits par le glucose ou d'autres sources de carbone pour le métabolisme mitochondrial dans le microenvironnement tumoral (TME) n'ont pas encore été déterminés. L'attribution de la présence ou de l'absence de métabolites à un sous-ensemble donné de lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL) nécessite la purification de la population cellulaire à partir du tissu excisé. Par conséquent, notre méthode d'enrichissement cellulaire, combinée à la spectrométrie de masse, peut fournir des informations sur les métabolites différentiellement enrichis dans les lymphocytes T et les populations de cellules tumorales dans des échantillons de patients appariés. Bien que cette méthode présente des avantages par rapport au tri cellulaire par cytométrie en flux (FACS), certaines bibliothèques de métabolites peuvent être affectées en raison de leur stabilité intrinsèque et/ou de leur taux de renouvellement rapide (22). Néanmoins, notre méthode a permis d'identifier deux métabolites immunosuppresseurs reconnus, l'adénosine et la kynurénine, car leur concentration varie considérablement d'un type d'échantillon à l'autre.
Notre analyse métabolomique des tumeurs et des sous-types de TIL apporte un éclairage nouveau sur le rôle des métabolites dans le microenvironnement tumoral ovarien. Premièrement, la cytométrie en flux a permis de déterminer qu'il n'y avait pas de différence d'activité mitochondriale entre les tumeurs et les lymphocytes T CD4+. Cependant, l'analyse LC-MS/MS a révélé des variations significatives de l'abondance des métabolites au sein de ces populations, ce qui indique que les conclusions concernant le métabolisme des TIL et leur activité métabolique globale doivent être interprétées avec prudence. Deuxièmement, le MNA est le métabolite présentant la plus grande différence entre les cellules CD45- et les lymphocytes T dans l'ascite, et non dans les tumeurs. Par conséquent, la compartimentation et la localisation tumorale peuvent avoir des effets différents sur le métabolisme des TIL, ce qui souligne l'hétérogénéité potentielle au sein d'un microenvironnement donné. Troisièmement, l'expression de l'enzyme NNMT, productrice de MNA, est principalement limitée aux CAF, et dans une moindre mesure aux cellules tumorales, mais des niveaux détectables de MNA sont observés dans les lymphocytes T d'origine tumorale. La surexpression de NNMT dans les CAF ovariens est connue pour son effet pro-tumoral, notamment en stimulant le métabolisme des CAF, l'invasion tumorale et les métastases (27). Bien que le niveau global de TIL soit modéré, l'expression de NNMT dans les CAF est étroitement liée au sous-type mésenchymateux du Cancer Genome Atlas (TCGA), associé à un mauvais pronostic (27, 46, 47). Enfin, l'expression de l'enzyme AOX1, responsable de la dégradation du MNA, est également limitée à la population de CAF, ce qui indique que les lymphocytes T sont incapables de métaboliser le MNA. Ces résultats suggèrent que, bien que des études complémentaires soient nécessaires pour confirmer cette observation, des niveaux élevés de MNA dans les lymphocytes T pourraient indiquer la présence d'un microenvironnement immunosuppresseur au sein des CAF.
Étant donné le faible niveau d'expression des transporteurs de MNA et les niveaux indétectables des protéines clés impliquées dans le métabolisme du MNA, la présence de MNA dans les lymphocytes T est inattendue. Ni NNMT ni AOX1 n'ont pu être détectés par analyse scRNA-seq et qPCR ciblée sur deux cohortes indépendantes. Ces résultats indiquent que le MNA n'est pas synthétisé par les lymphocytes T, mais absorbé à partir du microenvironnement tumoral. Des expériences in vitro montrent que les lymphocytes T ont tendance à accumuler le MNA exogène.
Nos études in vitro ont montré que le MNA exogène induit l'expression du TNFα dans les lymphocytes T et renforce la liaison de Sp1 au promoteur du TNFα. Bien que le TNFα possède des propriétés antitumorales et pro-inflammatoires, dans le cancer de l'ovaire, il peut favoriser la croissance tumorale (31-33). La neutralisation du TNFα dans les cultures de cellules tumorales ovariennes ou l'élimination de la signalisation du TNFα dans des modèles murins peuvent améliorer la production de cytokines inflammatoires induite par le TNFα et inhiber la croissance tumorale (32, 35). Ainsi, dans ce cas, le MNA dérivé du microenvironnement tumoral peut agir comme un métabolite pro-inflammatoire via un mécanisme dépendant du TNFα par l'intermédiaire d'une boucle autocrine, favorisant ainsi l'apparition et la dissémination du cancer de l'ovaire (31). C'est pourquoi le blocage du TNFα est étudié comme agent thérapeutique potentiel pour le cancer de l'ovaire (37, 48, 49). De plus, le MNA altère la cytotoxicité des cellules CAR-T envers les cellules tumorales ovariennes, confirmant ainsi l'immunosuppression induite par le MNA. L'ensemble de ces résultats suggère un modèle dans lequel les tumeurs et les cellules CAF sécrètent du MNA dans le microenvironnement tumoral extracellulaire. Par (i) la stimulation de la croissance du cancer de l'ovaire induite par le TNF et (ii) l'inhibition de l'activité cytotoxique des lymphocytes T induite par le MNA, ce mécanisme pourrait avoir un double effet sur la tumeur (Figure 5D).
En conclusion, grâce à l'application combinée d'un enrichissement cellulaire rapide, du séquençage unicellulaire et du profilage métabolique, cette étude a révélé d'importantes différences immunométaboliques entre les cellules tumorales et les cellules d'ascite chez les patientes atteintes d'un carcinome séreux de haut grade. Cette analyse exhaustive a montré des différences d'absorption du glucose et d'activité mitochondriale entre les lymphocytes T et a identifié le MNA comme un métabolite immunorégulateur non autonome. Ces données ont un impact sur la façon dont le microenvironnement tumoral influence le métabolisme des lymphocytes T dans les cancers humains. Bien qu'une compétition directe pour les nutriments entre les lymphocytes T et les cellules cancéreuses ait été rapportée, les métabolites peuvent également agir comme régulateurs indirects, favorisant la progression tumorale et potentiellement supprimant les réponses immunitaires endogènes. Une meilleure caractérisation du rôle fonctionnel de ces métabolites régulateurs pourrait ouvrir la voie à des stratégies alternatives pour renforcer la réponse immunitaire antitumorale.
Les échantillons de patients et les données cliniques ont été obtenus auprès de la biobanque de tissus tumoraux du cancer de la Colombie-Britannique, certifiée par le Réseau canadien des biobanques de tissus. Conformément au protocole approuvé par le Comité d'éthique de la recherche sur le cancer de la Colombie-Britannique et l'Université de la Colombie-Britannique (H07-00463), tous les patients ayant donné leur consentement éclairé écrit ou ayant formellement renoncé à leur consentement ont fourni leurs échantillons et leurs données cliniques. Les échantillons sont conservés dans la biobanque certifiée (BRC-00290). Les caractéristiques détaillées des patients sont présentées dans les tableaux S1 et S5. Pour la cryoconservation, un scalpel est utilisé pour décomposer mécaniquement l'échantillon tumoral du patient, puis celui-ci est filtré à travers un filtre de 100 microns afin d'obtenir une suspension de cellules isolées. L'ascite du patient a été centrifugée à 1 500 tr/min pendant 10 minutes à 4 °C pour récupérer les cellules et éliminer le surnageant. Les cellules tumorales et ascitiques ont été cryoconservées dans une solution composée de 50 % de sérum AB humain inactivé par la chaleur (Sigma-Aldrich), de 40 % de milieu RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) et de 10 % de diméthylsulfoxyde. Ces suspensions de cellules uniques ont ensuite été décongelées et utilisées pour les analyses métabolomiques et le dosage des métabolites décrits ci-dessous.
Le milieu de culture complet est composé de RPMI 1640 et d'AimV (Invitrogen) filtrés à 0,22 μm (50:50). Le RPMI 1640 contient 2,05 mM de L-glutamine (Thermo Fisher Scientific), 10 % de sérum AB humain inactivé par la chaleur (Sigma-Aldrich), 12,5 mM d'Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM de L-glutamine (Thermo Fisher Scientific), une solution de pénicilline-streptomycine (PenStrep) 1× (Thermo Fisher Scientific) et 50 μM de β-mercaptoéthanol. L'AimV contient 20 mM d'Hepes (Thermo Fisher Scientific) et 2 mM de L-glutamine (Thermo Fisher Scientific). Le tampon de coloration pour cytomètre de flux était composé de PBS (Invitrogen) filtré à 0,22 μm et additionné de 3 % de sérum humain AB inactivé par la chaleur (Sigma). Le tampon d'enrichissement cellulaire était composé de PBS filtré à 0,22 μm et additionné de 0,5 % de sérum humain AB inactivé par la chaleur (Sigma-Aldrich).
Dans un milieu complet à 37 °C, les cellules ont été incubées avec 10 nM de MT DR et 100 μM de 2-NBDG pendant 30 minutes. Elles ont ensuite été colorées avec le colorant de viabilité eF506 à 4 °C pendant 15 minutes. Les cellules ont été remises en suspension dans du FC Block (eBioscience) et du Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), diluées dans un tampon de coloration pour cytomètre de flux (selon les instructions du fabricant) et incubées pendant 10 minutes à température ambiante. Elles ont ensuite été colorées avec un ensemble d'anticorps (Tableau S2) dans un tampon de coloration pour cytométrie de flux à 4 °C pendant 20 minutes. Enfin, les cellules ont été remises en suspension dans ce même tampon (Cytek Aurora ; configuration 3L-16V-14B-8R) avant l'analyse. Les données de comptage cellulaire ont été analysées avec SpectroFlo et FlowJo V10, et les données ont été traitées avec GraphPad Prism 8. L'intensité de fluorescence médiane (IFM) du 2-NBDG et du MT DR a été normalisée par logarithme, puis un test t apparié a été utilisé pour l'analyse statistique afin de tenir compte de l'appariement des patients. Toutes les populations comportant moins de 40 événements ont été exclues de l'analyse ; les valeurs d'IFM négatives ont été fixées à 1 avant l'analyse statistique et la visualisation des données.
Afin de compléter la stratégie de sélection manuelle décrite précédemment, nous avons utilisé l'annotation complète par arbre de restriction de forme (FAUST) (21) pour assigner automatiquement les cellules à la population après élimination des cellules mortes dans FlowJo. Nous avons ensuite traité manuellement les résultats pour fusionner les populations apparemment mal assignées (combinaison de cellules tumorales PD1+ et PD1-) et conserver les populations restantes. Chaque échantillon contient en moyenne plus de 2 % de cellules, pour un total de 11 populations.
La centrifugation sur gradient de Ficoll a été utilisée pour séparer les PBMC des produits de séparation leucocytaire (STEMCELL Technologies). Les lymphocytes T CD8+ ont été isolés des PBMC à l'aide de microbilles CD8 (Miltenyi) et amplifiés dans un milieu complet avec TransAct (Miltenyi) pendant 2 semaines, conformément aux instructions du fabricant. Les cellules ont ensuite été incubées pendant 5 jours dans un milieu complet contenant de l'IL-7 (10 ng/ml ; PeproTech), puis restimulées avec TransAct. Au 7e jour, conformément aux instructions du fabricant, des microbilles CD45 humaines (Miltenyi) ont été utilisées pour enrichir les cellules en trois cycles consécutifs. Les cellules ont été aliquotées pour l'analyse par cytométrie en flux (comme décrit précédemment), et un million de cellules ont été aliquotées trois fois pour l'analyse par LC-MS/MS. Les échantillons ont été traités par LC-MS/MS comme décrit ci-dessous. La valeur du métabolite manquant a été estimée avec un nombre d'ions de 1 000. Chaque échantillon est normalisé par le nombre total d'ions (TIC), converti logarithmiquement et normalisé automatiquement dans MetaboAnalystR avant l'analyse.
La suspension monocellulaire de chaque patient a été décongelée et filtrée sur un filtre de 40 μm dans un milieu complet (comme décrit précédemment). Conformément au protocole du fabricant, trois cycles consécutifs de sélection positive par séparation sur billes magnétiques (MicroBeads, Miltenyi) ont été utilisés pour enrichir les échantillons en cellules CD8+, CD4+ et CD45- (sur glace). Brièvement, les cellules sont remises en suspension dans le tampon d'enrichissement cellulaire (comme décrit précédemment) et comptées. Elles sont ensuite incubées avec des billes CD8, CD4 ou CD45 humaines (Miltenyi) à 4 °C pendant 15 minutes, puis lavées avec le tampon d'enrichissement cellulaire. L'échantillon est passé sur une colonne LS (Miltenyi), et les fractions positives et négatives sont collectées. Afin de réduire la durée de la procédure et d'optimiser la récupération cellulaire, la fraction CD8- est utilisée pour un second cycle d'enrichissement CD4+, et la fraction CD4- pour un enrichissement CD45-. Maintenir la solution sur glace pendant toute la durée du processus de séparation.
Pour préparer les échantillons destinés à l'analyse des métabolites, les cellules ont été lavées une fois avec une solution saline glacée, puis 1 ml de méthanol à 80 % a été ajouté à chaque échantillon. Après agitation au vortex, les échantillons ont été congelés instantanément dans l'azote liquide. Ils ont ensuite subi trois cycles de congélation-décongélation et ont été centrifugés à 14 000 tr/min pendant 15 minutes à 4 °C. Le surnageant contenant les métabolites a été évaporé à sec. Les métabolites ont été redissous dans 50 µl d'acide formique à 0,03 %, agités au vortex pour homogénéiser la solution, puis centrifugés afin d'éliminer les débris.
Extraire les métabolites comme décrit précédemment. Transférer le surnageant dans un flacon de chromatographie liquide haute performance (HPLC) pour analyse métabolomique. Utiliser un protocole de traitement aléatoire afin de traiter chaque échantillon avec un nombre similaire de cellules et ainsi éviter les effets de lot. Nous avons réalisé une évaluation qualitative des métabolites totaux, précédemment publiée, sur le spectromètre de masse à triple quadripôle AB SCIEX QTRAP 5500 (50). L'analyse chromatographique et l'intégration des aires des pics ont été effectuées à l'aide du logiciel MultiQuant version 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Un comptage ionique de 1000 a été utilisé pour estimer la valeur manquante des métabolites, et le TIC de chaque échantillon a servi à calculer l'aire du pic normalisée de chaque métabolite détecté afin de corriger les variations introduites par l'analyse instrumentale lors du traitement des échantillons. Après normalisation du TIC, MetaboAnalystR(51) (paramètres par défaut) a été utilisé pour la conversion logarithmique et la normalisation automatique. Nous avons utilisé l'ACP avec le package vegan de R pour réaliser une analyse exploratoire des différences de métabolome entre les types d'échantillons, et une analyse de redondance partielle pour analyser les patients. La méthode de Ward a été utilisée pour construire un dendrogramme de type carte thermique afin de regrouper les échantillons selon la distance euclidienne. Nous avons utilisé limma(52) sur l'abondance standardisée des métabolites pour identifier les métabolites différentiellement abondants dans l'ensemble du type cellulaire et du microenvironnement. Afin de simplifier l'explication, nous avons utilisé le paramètre de moyenne de groupe pour spécifier le modèle, et considéré les types cellulaires du microenvironnement comme chaque groupe (n = 6 groupes). Pour le test de signification, nous avons effectué trois mesures répétées pour chaque métabolite. Afin d'éviter les faux positifs, le patient a été inclus comme obstacle dans le modèle limma. Pour vérifier les différences de métabolites entre les patients, nous avons ajusté le modèle limma en incluant les patients de manière fixe. Nous rapportons la signification du contraste prédéfini entre le type cellulaire et le microenvironnement (p < 0,05 après correction de Benjamini-Hochberg).
Après enrichissement en cellules viables à l'aide du kit d'élimination des cellules mortes Miltenyi (viabilité > 80 %), un séquençage du transcriptome unicellulaire a été réalisé sur l'ensemble des échantillons d'ascite et de tumeur congelés et vivants, selon un protocole d'expression génique 5' 10x. Cinq cas présentant des tumeurs et des ascites appariées ont été analysés, bien que la faible viabilité d'un échantillon tumoral ait empêché son inclusion. Afin d'obtenir plusieurs sélections de patients, les échantillons de chaque patient ont été combinés dans les voies du contrôleur 10x Chromoium, et les sites d'ascite et de tumeur ont été analysés séparément. Après séquençage [Illumina HiSeq 4000 28×98 pb, apparié (PE), génome du Québec ; Avec une moyenne de 73 488 et 41 378 lectures par cellule pour la tumeur et l’ascite respectivement, nous avons utilisé CellSNP et Vireo (53) (basé sur CellSNP). Le SNP humain commun (VCF) fourni par GRCh38 se voit attribuer une identité de donneur. Nous utilisons SNPRelate pour inférer l’identité la plus proche (IBS) du génotype du patient (IBS), en excluant les cellules non assignées et les cellules identifiées comme duplexes, et en appariant les donneurs entre les échantillons d’ascite et de tumeur (54). Sur la base de cette tâche, nous avons conservé trois cas avec une représentation cellulaire abondante dans la tumeur et l’ascite pour l’analyse ultérieure. Après avoir effectué une étape de filtrage massif dans les packages scater (55) et scran (56) de BioConductor, cela a donné 6 975 cellules (2 792 et 4 183 cellules provenant respectivement de la tumeur et de l’ascite) pour l’analyse. Nous utilisons le clustering de Louvain d’igraph (57) du réseau de voisins les plus proches partagés (SNN) basé sur la distance de Jaccard Les cellules ont été regroupées par expression. Les groupes ont été annotés manuellement en types cellulaires putatifs d'après l'expression de gènes marqueurs et visualisés par t-SNE. Les lymphocytes T cytotoxiques sont définis par l'expression de CD8A et GZMA, à l'exclusion des sous-groupes présentant une faible expression de protéines ribosomiques. Nous avons utilisé les données publiées par Izar et al. (16), notamment leur intégration t-SNE, permettant de contrôler le chevauchement d'expression entre les marqueurs de cellules immunitaires et l'expression de NNMT.
Les PBMC ont été séparées des produits de séparation leucocytaire (STEMCELL Technologies) par centrifugation sur gradient de Ficoll. Les cellules CD3+ ont été isolées des PBMC à l'aide de billes CD3 (Miltenyi). En présence ou en absence de MNA, les cellules CD3+ ont été activées avec du CD3 fixé sur plaque (5 μg/ml), du CD28 soluble (3 μg/ml) et de l'IL-2 (300 U/ml ; Proleukin). Le dernier jour de l'expansion, la viabilité (colorant de viabilité fixable eFluor450, eBioscience) et la prolifération (billes eBeads 123count, Thermo Fisher Scientific) ont été évaluées par cytométrie en flux. Évaluer la fonction effectrice en stimulant les cellules avec du PMA (20 ng/ml) et de l'ionomycine (1 μg/ml) en présence de GolgiStop pendant 4 heures, et suivre l'expression de CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4, BioLegend) et de TNFα-FITC (MAb11, BD). Stimuler les cellules pour la qPCR et la ChIP avec du PMA (20 ng/ml) et de l'ionomycine (1 μg/ml) pendant 4 heures. Le surnageant ELISA a été recueilli avant et après stimulation avec du PMA (20 ng/ml) et de l'ionomycine (1 μg/ml) pendant 4 heures.
Suivez le protocole du fabricant pour isoler l'ARN à l'aide du kit RNeasy Plus Mini (QIAGEN). Utilisez le QIAshredder (QIAGEN) pour homogénéiser l'échantillon. Utilisez le kit de synthèse d'ADNc à partir d'ARN haute capacité (Thermo Fisher Scientific) pour synthétiser l'ADN complémentaire (ADNc). Utilisez le TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) pour quantifier l'expression génique (conformément au protocole du fabricant) avec les sondes suivantes : Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH)] et Hs01010726_m1 (SLC22A2). Les échantillons ont été analysés par PCR en temps réel sur le système StepOnePlus (Applied Biosystems) dans une plaque de réaction optique rapide 96 puits MicroAmp (Applied Biosystems) avec film optique MicroAmp. Toute valeur Ct supérieure à 35 est considérée comme non détectable.
Réalisez la ChIP comme décrit précédemment (58). Brièvement, les cellules ont été traitées au formaldéhyde (concentration finale de 1,42 %) et incubées à température ambiante pendant 10 minutes. Utilisez un tampon de gonflement supplémenté (Hepes 25 mM, MgCl₂ 1,5 mM, KCl 10 mM et NP-40 0,1 %) et incubez-les sur glace pendant 10 minutes, puis remettez-les en suspension dans le tampon d'immunoprécipitation comme décrit (58). L'échantillon a ensuite été soniqué selon le protocole suivant : 10 cycles (20 impulsions de 1 seconde) et une étape statique de 40 secondes. Incubez les anticorps suivants (immunoglobuline G de qualité ChIP, Cell Signaling Technology ; 1 µl), anti-histone H3, anti-NFAT et anti-SP1 (Cell Signaling Technology ; 3 µl, 3 µl, Invitrogen) avec l'échantillon à 4 °C sous agitation pendant une nuit. Incuber les billes de protéine A (Thermo Fisher Scientific) avec l'échantillon à 4 °C sous agitation douce pendant 1 heure, puis utiliser des billes Chelex (Bio-Rad) pour enrichir l'ADN et la protéinase K (Thermo Fisher) pour la digestion des protéines. Le promoteur de TNFα a été détecté par PCR : amorce sens, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT ; amorce antisens, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (produit de 207 pb). Les images ont été produites par Image Lab (Bio-Rad) et quantifiées à l'aide du logiciel ImageJ.
Le surnageant de culture cellulaire a été recueilli comme décrit précédemment. Le dosage a été réalisé selon les instructions du fabricant pour les kits ELISA TNFα humain (Invitrogen), IL-2 humain (Invitrogen) et IFN-γ humain (Abcam). Conformément au protocole du fabricant, le surnageant a été dilué au 1/100 pour le dosage du TNFα et de l'IL-2, et au 1/3 pour celui de l'IFN-γ. L'absorbance a été mesurée à 450 nm à l'aide du lecteur de microplaques EnVision 2104 (PerkinElmer).
Les PBMC ont été séparées des produits de séparation leucocytaire (STEMCELL Technologies) par centrifugation sur gradient de Ficoll. Les cellules CD3+ ont été isolées des PBMC à l'aide de billes CD3 (Miltenyi). En présence ou en absence de MNA, les cellules CD3+ ont été activées pendant 3 jours avec du CD3 fixé sur plaque (5 μg/ml), du CD28 soluble (3 μg/ml) et de l'IL-2 (300 U/ml ; Proleukin). Après 3 jours, les cellules ont été collectées et lavées avec une solution saline à 0,9 %, puis le culot a été congelé instantanément. Le comptage cellulaire a été réalisé par cytométrie en flux (Cytek Aurora ; configuration 3L-16V-14B-8R) à l'aide de billes eBeads 123count.
Les métabolites ont été extraits selon la méthode décrite précédemment. L'extrait sec a été reconstitué à une concentration de 4 000 équivalents cellulaires/µl. L'échantillon a été analysé par chromatographie en phase inverse (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) sur une colonne CORTECS T3 (2,1 × 150 mm, granulométrie 1,6 µm, porosité 120 Å ; réf. 186008500, Waters). L'analyse a été réalisée par spectrométrie de masse à polarité positive (6470, Agilent), avec ionisation par électrospray en mode positif. La phase mobile A était composée d'acide formique à 0,1 % (dans l'eau), et la phase mobile B d'acétonitrile à 90 % et d'acide formique à 0,1 %. Le gradient de chromatographie liquide (CL) est le suivant : 0 à 2 minutes pour 100 % de phase A, 2 à 7,1 minutes pour 99 % de phase B, puis 7,1 à 8 minutes pour 99 % de phase B. La colonne est ensuite rééquilibrée avec la phase mobile A à un débit de 0,6 ml/min pendant 3 minutes. Le débit est alors de 0,4 ml/min et la chambre de la colonne est chauffée à 50 °C. L’étalon chimique pur de MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) est utilisé pour déterminer le temps de rétention (TR) et la transformation (TR = 0,882 minute, transformation 1 = 137→94,1, transformation 2 = 137→92, transformation 3 = 137→78). Lorsque les trois transitions se produisent au temps de rétention attendu, la transition 1 est utilisée pour la quantification afin de garantir la spécificité. La courbe d'étalonnage du MNA (Toronto Research Chemical Company) a été établie par six dilutions en série d'une solution mère (1 mg/ml) afin d'obtenir des solutions étalons de concentrations respectives de 0,1, 1,0, 10 et 100 ng/ml et de 1,0 et 10 µg/ml. La limite de détection est de 1 ng/ml et la réponse linéaire se situe entre 10 ng/ml et 10 µg/ml. Deux microlitres d'échantillon et de solution étalon sont injectés pour chaque analyse LC/MS. Un échantillon de contrôle de qualité mixte est analysé toutes les huit injections afin de garantir la stabilité de la plateforme. Les réponses au MNA de tous les échantillons cellulaires traités se situaient dans la plage de linéarité du dosage. L'analyse des données a été réalisée à l'aide du logiciel d'analyse quantitative MassHunter (v9.0, Agilent).
Le vecteur αFR-CAR de deuxième génération a été dérivé de celui décrit par Song et al. (59). Ce vecteur contient les éléments suivants : la séquence signal CD8a, le fragment variable monocaténaire spécifique de l’αFR humain, la région charnière et transmembranaire de CD8a, le domaine intracellulaire de CD27 et le domaine intracellulaire de CD3ε. La séquence CAR complète a été synthétisée par GenScript, puis clonée dans le vecteur d’expression lentiviral de deuxième génération en amont de la cassette d’expression de la GFP utilisée pour évaluer l’efficacité de transduction.
Le lentivirus est produit par transfection de cellules HEK293T (American Type Culture Collection [ATCC]) cultivées dans du milieu de Dulbecco modifié (DMEM) contenant 10 % de sérum de veau fœtal (SVF) et 1 % de pénicilline-streptomycine (PenStrep). Le vecteur CAR-GFP et les plasmides d'encapsidation (psPAX2 et pMD2.G, Addgene) sont utilisés pour la lipofection par amine (Sigma-Aldrich). Le surnageant contenant le virus est recueilli 48 et 72 heures après la transfection, filtré, puis concentré par ultracentrifugation. Le surnageant viral concentré est conservé à -80 °C jusqu'à la transduction.
Les PBMC sont séparées des produits de séparation leucocytaire de donneurs sains (STEMCELL Technologies) par centrifugation sur gradient de densité de Ficoll. Les cellules CD8+ sont isolées des PBMC à l'aide de microbilles de sélection positive CD8 (Miltenyi). Les lymphocytes T sont stimulés avec TransAct (Miltenyi) dans le milieu TexMACS [Miltenyi ; supplémenté avec 3 % de sérum humain inactivé par la chaleur, 1 % de pénicilline-streptomycine et IL-2 (300 U/ml)]. Vingt-quatre heures après la stimulation, les lymphocytes T sont transduits avec un lentivirus (10 μl de surnageant viral concentré pour 10⁶ cellules). Un à trois jours après la transduction, l'expression de la GFP est évaluée sur un cytomètre Cytek Aurora (FSC/SSC, Singlet, GFP+) afin de démontrer une efficacité de transduction d'au moins 30 %.
Les cellules CAR-T ont été cultivées pendant 24 heures dans du milieu Immunocult (STEMCELL Technologies ; supplémenté avec 1 % de pénicilline-streptomycine) dans les conditions suivantes : non traitées, traitées avec 250 μM d'adénosine ou 10 mM de MNA. Après prétraitement, les cellules CAR-T ont été lavées avec du PBS et combinées avec 20 000 cellules SK-OV-3 [ATCC ; dans du milieu McCoy 5A (Sigma-Aldrich) supplémenté avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine à un ratio effecteur/cible de 1:1]. Ce ratio a été amplifié en triplicata dans du milieu Immunocult supplémenté. Les cellules SK-OV-3 et les cellules SK-OV-3 lysées avec de la saponine digitalique (0,5 mg/ml ; Sigma-Aldrich) ont été utilisées comme témoins négatif et positif, respectivement. Après 24 heures de co-culture, le surnageant a été recueilli et l'activité de la lactate déshydrogénase (LDH) a été mesurée selon les instructions du fabricant (kit de dosage de cytotoxicité LDH Glo, Promega). Le surnageant a été dilué au 1/50e dans un tampon LDH. Le pourcentage de lyse a été calculé à l'aide de la formule suivante : pourcentage de lyse = pourcentage de correction / taux de lyse maximal × 100 %, où le pourcentage de correction correspond à la différence entre les cellules T en co-culture et les cellules T seules, et le taux de lyse maximal à la différence entre le contrôle positif et le contrôle négatif.
Comme décrit dans la section « Matériels et méthodes », utilisez GraphPad Prism 8, Microsoft Excel ou R v3.6.0 pour l’analyse statistique. Si plusieurs échantillons sont prélevés chez un même patient (par exemple, ascite et tumeur), nous utilisons un test t apparié ou intégrons le patient comme effet aléatoire dans un modèle linéaire ou généralisé, selon le cas. Pour l’analyse métabolomique, le test d’importance est réalisé en trois exemplaires.
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Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phinéas T.
L'MNA contribue à l'immunosuppression des lymphocytes T et représente une cible potentielle d'immunothérapie pour le traitement du cancer chez l'homme.
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