L'acide propionique (PPA), un antifongique et additif alimentaire courant, induit chez la souris des anomalies du développement neurologique accompagnées de dysfonctionnements gastro-intestinaux, possiblement liés à une dysbiose intestinale. Un lien entre l'exposition alimentaire au PPA et la dysbiose du microbiote intestinal a été suggéré, mais n'a pas encore fait l'objet d'études directes. Dans cette étude, nous avons examiné les modifications de la composition du microbiote intestinal associées au PPA et susceptibles d'induire une dysbiose. Les microbiomes intestinaux de souris soumises à un régime alimentaire standard (n=9) et à un régime enrichi en PPA (n=13) ont été séquencés par métagénomique à longue portée afin d'évaluer les différences de composition microbienne et de voies métaboliques bactériennes. L'apport alimentaire de PPA était associé à une augmentation de l'abondance de taxons significatifs, notamment plusieurs espèces de Bacteroides, Prevotella et Ruminococcus, dont certaines sont impliquées dans la production de PPA. Les microbiomes des souris exposées au PPA présentaient également un plus grand nombre de voies métaboliques liées au métabolisme lipidique et à la biosynthèse des hormones stéroïdiennes. Nos résultats indiquent que le PPA peut altérer le microbiote intestinal et ses voies métaboliques associées. Ces modifications observées soulignent que les conservateurs classés comme sûrs pour la consommation peuvent influencer la composition du microbiote intestinal et, par conséquent, la santé humaine. Parmi ces marqueurs, P, G ou S est sélectionné en fonction du niveau de classification analysé. Afin de minimiser l'impact des faux positifs, un seuil minimal d'abondance relative de 1e-4 (1/10 000 lectures) a été adopté. Avant l'analyse statistique, les abondances relatives rapportées par Bracken (fraction_total_reads) ont été transformées par la transformation logarithmique centrée (CLR) (Aitchison, 1982). La méthode CLR a été choisie pour la transformation des données car elle est invariante d'échelle et adaptée aux jeux de données non clairsemés (Gloor et al., 2017). La transformation CLR utilise le logarithme népérien. Les données de comptage rapportées par Bracken ont été normalisées à l'aide de l'expression logarithmique relative (RLE) (Anders et Huber, 2010). Les figures ont été générées à l'aide de matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 et de logarithmes séquentiels (Gloor et al., 2017). Les données ont été analysées avec les logiciels 0.12.2 et stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007 ; Waskom, 2021 ; Charlier et al., 2022). Le rapport Bacillus/Bacteroidetes a été calculé pour chaque échantillon à partir des dénombrements bactériens normalisés. Les valeurs présentées dans les tableaux sont arrondies à quatre décimales. L’indice de diversité de Simpson a été calculé à l’aide du script alpha_diversity.py fourni dans le package KrakenTools v. 1.2 (Lu et al., 2022). Le rapport de Bracken est fourni dans le script et l’indice de Simpson « Si » est fourni pour le paramètre -an. Les différences d’abondance significatives ont été définies comme des différences moyennes de CLR ≥ 1 ou ≤ -1. Une différence moyenne de CLR de ±1 indique une augmentation de 2,7 fois de l’abondance d’un type d’échantillon. Le signe (+/-) indique si le taxon est plus abondant dans l’échantillon PPA et dans l’échantillon témoin, respectivement. La significativité a été déterminée à l'aide du test U de Mann-Whitney (Virtanen et al., 2020). Le logiciel Statsmodels v. 0.14 (Benjamini et Hochberg, 1995 ; Seabold et Perktold, 2010) a été utilisé, et la procédure de Benjamini-Hochberg a été appliquée pour corriger les tests multiples. Un seuil de significativité statistique ajusté de p ≤ 0,05 a été retenu.
Le microbiome humain est souvent qualifié de « dernier organe du corps » et joue un rôle vital pour la santé humaine (Baquero et Nombela, 2012). Le microbiome intestinal, en particulier, est reconnu pour son influence systémique et son rôle dans de nombreuses fonctions essentielles. Les bactéries commensales y sont abondantes, occupant de multiples niches écologiques, utilisant les nutriments et entrant en compétition avec les pathogènes potentiels (Jandhyala et al., 2015). Divers composants bactériens du microbiote intestinal sont capables de produire des nutriments essentiels tels que des vitamines et de favoriser la digestion (Rowland et al., 2018). Il a également été démontré que les métabolites bactériens influencent le développement tissulaire et stimulent les voies métaboliques et immunitaires (Heijtz et al., 2011 ; Yu et al., 2022). La composition du microbiome intestinal humain est extrêmement diverse et dépend de facteurs génétiques et environnementaux tels que l'alimentation, le sexe, les médicaments et l'état de santé (Kumbhare et al., 2019).
L'alimentation maternelle est un élément essentiel du développement fœtal et néonatal et une source potentielle de composés susceptibles d'influencer ce développement (Bazer et al., 2004 ; Innis, 2014). Parmi ces composés, l'acide propionique (PPA), un acide gras à chaîne courte issu de la fermentation bactérienne et utilisé comme additif alimentaire (den Besten et al., 2013), présente un intérêt particulier. Le PPA possède des propriétés antibactériennes et antifongiques et est donc employé comme conservateur alimentaire et dans des applications industrielles pour inhiber la croissance des moisissures et des bactéries (Wemmenhove et al., 2016). Ses effets varient selon les tissus. Dans le foie, le PPA exerce des effets anti-inflammatoires en modulant l'expression des cytokines dans les macrophages (Kawasoe et al., 2022). Cet effet régulateur a également été observé dans d'autres cellules immunitaires, entraînant une diminution de l'inflammation (Haase et al., 2021). En revanche, l'effet inverse a été observé dans le cerveau. Des études antérieures ont montré que l'exposition au PPA induit des comportements de type autistique chez la souris (El-Ansary et al., 2012). D'autres études ont démontré que le PPA peut induire une gliose et activer des voies pro-inflammatoires dans le cerveau (Abdelli et al., 2019). Le PPA étant un acide faible, il peut diffuser à travers l'épithélium intestinal et passer dans la circulation sanguine, franchissant ainsi des barrières importantes telles que la barrière hémato-encéphalique et le placenta (Stinson et al., 2019). Ceci souligne l'importance du PPA en tant que métabolite régulateur produit par les bactéries. Bien que le rôle potentiel du PPA comme facteur de risque d'autisme soit actuellement à l'étude, ses effets chez les personnes autistes pourraient aller au-delà de la simple induction de la différenciation neuronale.
Les symptômes gastro-intestinaux tels que la diarrhée et la constipation sont fréquents chez les patients atteints de troubles neurodéveloppementaux (Cao et al., 2021). Des études antérieures ont montré que le microbiome des patients atteints de troubles du spectre autistique (TSA) diffère de celui des individus sains, suggérant une dysbiose intestinale (Finegold et al., 2010). De même, les caractéristiques du microbiome des patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, d'obésité, de la maladie d'Alzheimer, etc., diffèrent également de celles des individus sains (Turnbaugh et al., 2009 ; Vogt et al., 2017 ; Henke et al., 2019). Cependant, à ce jour, aucun lien de causalité n'a été établi entre le microbiome intestinal et les maladies ou symptômes neurologiques (Yap et al., 2021), bien que plusieurs espèces bactériennes soient suspectées de jouer un rôle dans certains de ces états pathologiques. Par exemple, les genres Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio et d'autres sont plus abondants dans le microbiote des patients autistes (Tomova et al., 2015 ; Golubeva et al., 2017 ; Cristiano et al., 2018 ; Zurita et al., 2020). Notamment, certaines espèces appartenant à ces genres possèdent des gènes associés à la production de PPA (Reichardt et al., 2014 ; Yun et Lee, 2016 ; Zhang et al., 2019 ; Baur et Dürre, 2023). Compte tenu des propriétés antimicrobiennes du PPA, une augmentation de son abondance pourrait favoriser la croissance des bactéries productrices de PPA (Jacobson et al., 2018). Ainsi, un environnement riche en PFA peut entraîner des modifications du microbiote intestinal, notamment des agents pathogènes gastro-intestinaux, qui peuvent être des facteurs potentiels à l'origine de symptômes gastro-intestinaux.
Une question centrale de la recherche sur le microbiome est de savoir si les différences de composition microbienne sont une cause ou un symptôme de maladies sous-jacentes. La première étape pour élucider la relation complexe entre l'alimentation, le microbiome intestinal et les maladies neurologiques consiste à évaluer les effets de l'alimentation sur la composition microbienne. À cette fin, nous avons utilisé le séquençage métagénomique à longues lectures pour comparer les microbiomes intestinaux de la progéniture de souris soumises à un régime alimentaire riche ou pauvre en PPA. La progéniture a reçu le même régime alimentaire que sa mère. Nous avons émis l'hypothèse qu'un régime riche en PPA entraînerait des modifications de la composition microbienne intestinale et des voies fonctionnelles microbiennes, en particulier celles liées au métabolisme et/ou à la production de PPA.
Cette étude a utilisé des souris transgéniques FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories) surexprimant la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle du promoteur GFAP spécifique des cellules gliales, conformément aux directives du Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Floride centrale (UCF-IACUC) (Numéro d'autorisation d'utilisation des animaux : PROTO202000002). Après le sevrage, les souris ont été logées individuellement dans des cages, à raison de 1 à 5 souris de chaque sexe par cage. Elles ont été nourries ad libitum avec soit un régime témoin purifié (régime standard modifié, 16 % de lipides), soit un régime supplémenté en propionate de sodium (régime standard modifié, 16 % de lipides, contenant 5 000 ppm de propionate de sodium). La quantité de propionate de sodium utilisée était équivalente à 5 000 mg de PFA/kg de poids total d'aliment. Il s'agit de la concentration maximale de PPA autorisée comme conservateur alimentaire. Pour préparer cette étude, les souris reproductrices ont été soumises aux deux régimes alimentaires pendant 4 semaines avant l'accouplement et tout au long de la gestation. Les souriceaux [22 souris, 9 témoins (6 mâles, 3 femelles) et 13 PPA (4 mâles, 9 femelles)] ont été sevrés puis nourris avec le même régime alimentaire que leurs mères pendant 5 mois. À l'âge de 5 mois, les souriceaux ont été sacrifiés et leur contenu fécal a été prélevé et initialement conservé dans des tubes à microcentrifuger de 1,5 ml à -20 °C, puis transféré à -80 °C jusqu'à élimination complète de l'ADN hôte et extraction des acides nucléiques microbiens.
L’ADN de l’hôte a été éliminé selon un protocole modifié (Charalampous et al., 2019). Brièvement, le contenu fécal a été transféré dans 500 µl d’InhibitEX (Qiagen, réf. : 19593) et congelé. Un maximum de 1 à 2 culots fécaux ont été traités par extraction. Le contenu fécal a ensuite été homogénéisé mécaniquement à l’aide d’un pilon en plastique dans le tube afin d’obtenir une suspension. Les échantillons ont été centrifugés à 10 000 g pendant 5 min ou jusqu’à formation d’un culot, puis le surnageant a été aspiré et le culot remis en suspension dans 250 µl de PBS 1×. 250 µl de solution de saponine à 4,4 % (TCI, réf. S0019) ont été ajoutés à l’échantillon comme détergent pour ramollir les membranes cellulaires eucaryotes. Les échantillons ont été mélangés délicatement jusqu’à obtention d’une suspension homogène et incubés à température ambiante pendant 10 min. Pour lyser les cellules eucaryotes, 350 μl d'eau sans nucléase ont été ajoutés à l'échantillon, incubés pendant 30 s, puis 12 μl de NaCl 5 M ont été ajoutés. Les échantillons ont ensuite été centrifugés à 6 000 g pendant 5 min. Le surnageant a été aspiré et le culot remis en suspension dans 100 μl de PBS 1X. Pour éliminer l'ADN de l'hôte, 100 μl de tampon HL-SAN (12,8568 g de NaCl, 4 ml de MgCl₂ 1 M, 36 ml d'eau sans nucléase) et 10 μl d'enzyme HL-SAN (ArticZymes, réf. 70910-202) ont été ajoutés. Les échantillons ont été soigneusement mélangés par pipetage et incubés à 37 °C pendant 30 min à 800 tr/min sur un homogénéisateur Eppendorf™ ThermoMixer C. Après incubation, ils ont été centrifugés à 6 000 g pendant 3 min et lavés deux fois avec 800 µl et 1 000 µl de PBS 1X. Enfin, le culot a été remis en suspension dans 100 µl de PBS 1X.
L’ADN bactérien total a été isolé à l’aide du kit de purification d’ADN génomique Monarch de New England Biolabs (New England Biolabs, Ipswich, MA, réf. T3010L). Le protocole opératoire standard fourni avec le kit a été légèrement modifié. Incuber et maintenir de l’eau exempte de nucléases à 60 °C avant l’élution finale. Ajouter 10 µl de protéinase K et 3 µl de RNase A à chaque échantillon. Ajouter ensuite 100 µl de tampon de lyse cellulaire et mélanger délicatement. Les échantillons ont ensuite été incubés dans un thermomixer Eppendorf™ C à 56 °C et 1 400 tr/min pendant au moins 1 heure et jusqu’à 3 heures. Les échantillons incubés ont été centrifugés à 12 000 g pendant 3 minutes et le surnageant de chaque échantillon a été transféré dans un tube à microcentrifugation de 1,5 mL contenant 400 µl de solution de liaison. Les tubes ont ensuite été vortexés par impulsions pendant 5 à 10 secondes, à intervalles d'une seconde. Le contenu liquide de chaque échantillon (environ 600 à 700 µL) a été transféré dans une cartouche filtrante placée dans un tube de collecte à flux continu. Les tubes ont été centrifugés à 1 000 g pendant 3 minutes pour permettre la fixation initiale de l'ADN, puis à 12 000 g pendant 1 minute afin d'éliminer le liquide résiduel. La colonne d'échantillon a été transférée dans un nouveau tube de collecte, puis lavée deux fois. Pour le premier lavage, 500 µL de tampon de lavage ont été ajoutés à chaque tube. Le tube a été retourné 3 à 5 fois, puis centrifugé à 12 000 g pendant 1 minute. Le liquide du tube de collecte a été jeté et la cartouche filtrante a été replacée dans le même tube. Pour le second lavage, 500 µL de tampon de lavage ont été ajoutés au filtre sans retourner le tube. Les échantillons ont été centrifugés à 12 000 g pendant 1 minute. Transférer le filtre dans un tube LoBind® de 1,5 mL et ajouter 100 µL d'eau préchauffée sans nucléase. Incuber les filtres à température ambiante pendant 1 minute, puis les centrifuger à 12 000 g pendant 1 minute. L'ADN élué a été conservé à -80 °C.
La concentration d'ADN a été quantifiée à l'aide d'un fluorimètre Qubit™ 4.0. L'ADN a été préparé avec le kit Qubit™ 1X dsDNA haute sensibilité (réf. Q33231) selon les instructions du fabricant. La distribution de la longueur des fragments d'ADN a été mesurée à l'aide d'un système Agilent™ TapeStation 4150 ou 4200. L'ADN a été préparé avec les réactifs Agilent™ pour ADN génomique (réf. 5067-5366) et le ruban adhésif pour ADN génomique ScreenTape (réf. 5067-5365). La préparation des banques a été réalisée avec le kit de codage-barres PCR rapide Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) (SQK-RPB004) selon les instructions du fabricant. Le séquençage de l'ADN a été effectué avec un séquenceur ONT GridION™ Mk1 équipé d'une cellule de flux Min106D (R 9.4.1). Les paramètres de séquençage étaient les suivants : identification des bases avec une grande précision, valeur q minimale de 9, configuration et suppression des codes-barres. Les échantillons ont été séquencés pendant 72 heures, après quoi les données d’identification des bases ont été soumises à un traitement et une analyse plus approfondis.
Le traitement bioinformatique a été réalisé selon les méthodes décrites précédemment (Greenman et al., 2024). Les fichiers FASTQ obtenus par séquençage ont été répartis dans des répertoires pour chaque échantillon. Avant l'analyse bioinformatique, les données ont été traitées selon le pipeline suivant : les fichiers FASTQ des échantillons ont d'abord été fusionnés en un seul fichier FASTQ. Ensuite, les lectures inférieures à 1 000 pb ont été filtrées à l'aide de Filtlong v. 0.2.1, le seul paramètre modifié étant –min_length 1000 (Wick, 2024). Avant tout filtrage supplémentaire, la qualité des lectures a été contrôlée à l'aide de NanoPlot v. 1.41.3 avec les paramètres suivants : –fastq –plots dot –N50 -o
Pour la classification taxonomique, les lectures et les contigs assemblés ont été classés à l'aide de Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019). Des rapports et des fichiers de sortie ont été générés pour les lectures et les assemblages, respectivement. L'option `--use-names` a été utilisée pour analyser les lectures et les assemblages. Les options `--gzip-compressed` et `--paired` ont été spécifiées pour les segments de lecture. L'abondance relative des taxons dans les métagénomes a été estimée à l'aide de Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017). Une base de données de k-mers contenant 1 000 bases a d'abord été créée à l'aide de `bracken-build` avec les paramètres suivants : `-d`.
L'annotation des gènes et l'estimation de leur abondance relative ont été réalisées à l'aide d'une version modifiée du protocole décrit par Maranga et al. (Maranga et al., 2023). Dans un premier temps, les contigs de moins de 500 pb ont été supprimés de tous les assemblages à l'aide de SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). Les assemblages sélectionnés ont ensuite été combinés en un pan-métagénome. Les cadres de lecture ouverts (ORF) ont été identifiés à l'aide de Prodigal v. 1.0.1 (une version parallèle de Prodigal v. 2.6.3) avec les paramètres suivants : -d
Les gènes ont d'abord été regroupés selon les identifiants d'orthologues (KO) de l'Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes (KEGG) attribués par eggNOG afin de comparer l'abondance des voies métaboliques. Les gènes sans invalidation ou présentant plusieurs invalidations ont été exclus avant l'analyse. L'abondance moyenne de chaque KO par échantillon a ensuite été calculée et une analyse statistique a été réalisée. Les gènes du métabolisme du propionate (PPA) ont été définis comme tout gène auquel était attribué l'identifiant ko00640 dans la colonne KEGG_Pathway, indiquant un rôle dans le métabolisme du propionate selon KEGG. Les gènes identifiés comme associés à la production de PPA sont listés dans le Tableau supplémentaire 1 (Reichardt et al., 2014 ; Yang et al., 2017). Des tests de permutation ont été effectués pour identifier les gènes du métabolisme et de la production de PPA significativement plus abondants dans chaque type d'échantillon. Mille permutations ont été réalisées pour chaque gène analysé. Un seuil de signification statistique de p < 0,05 a été utilisé. Des annotations fonctionnelles ont été attribuées aux gènes individuels au sein d'un cluster, en se basant sur les annotations de gènes représentatifs de ce cluster. Les taxons associés au métabolisme et/ou à la production de PPA ont été identifiés par la correspondance des identifiants de contigs des fichiers de sortie de Kraken2 avec ceux conservés lors de l'annotation fonctionnelle à l'aide d'eggNOG. La significativité statistique a été évaluée par le test U de Mann-Whitney décrit précédemment. Une correction pour tests multiples a été appliquée selon la procédure de Benjamini-Hochberg. Un seuil de significativité de p ≤ 0,05 a été utilisé.
La diversité du microbiote intestinal des souris a été évaluée à l'aide de l'indice de diversité de Simpson. Aucune différence significative n'a été observée entre les échantillons témoins et les échantillons PPA en termes de diversité de genres et d'espèces (p pour les genres : 0,18 ; p pour les espèces : 0,16) (Figure 1). La composition microbienne a ensuite été comparée par analyse en composantes principales (ACP). La figure 2 montre le regroupement des échantillons par phylum, indiquant des différences dans la composition spécifique des microbiomes entre les échantillons PPA et témoins. Ce regroupement était moins marqué au niveau du genre, suggérant que le PPA affecte certaines bactéries (Figure supplémentaire 1).
Figure 1. Diversité alpha des genres et des espèces du microbiote intestinal de la souris. Diagrammes en boîte présentant les indices de diversité de Simpson pour les genres (A) et les espèces (B) dans les échantillons PPA et témoins. La significativité a été déterminée par le test U de Mann-Whitney, et une correction pour comparaisons multiples a été appliquée selon la procédure de Benjamini-Hochberg. ns : valeur p non significative (p > 0,05).
Figure 2. Résultats de l'analyse en composantes principales de la composition du microbiome intestinal de la souris au niveau de l'espèce. Le graphique d'analyse en composantes principales illustre la distribution des échantillons selon leurs deux premières composantes principales. Les couleurs indiquent le type d'échantillon : les souris exposées au PPA sont en violet et les souris témoins en jaune. Les composantes principales 1 et 2 sont représentées respectivement sur l'axe des abscisses et l'axe des ordonnées, et sont exprimées en pourcentage de variance expliquée.
L'analyse des données de comptage transformées par RLE a révélé une diminution significative du rapport médian Bacteroidetes/Bacilli chez les souris témoins et les souris PPA (témoins : 9,66 ; PPA : 3,02 ; p = 0,0011). Cette différence était due à une plus grande abondance de Bacteroidetes chez les souris PPA comparativement aux témoins, bien que cette différence ne soit pas significative (CLR moyen chez les témoins : 5,51 ; CLR moyen chez les souris PPA : 6,62 ; p = 0,054), tandis que l'abondance des Bacteroidetes était similaire (CLR moyen chez les témoins : 7,76 ; CLR moyen chez les souris PPA : 7,60 ; p = 0,18).
L'analyse de l'abondance des membres taxonomiques du microbiote intestinal a révélé qu'un phylum et 77 espèces différaient significativement entre les échantillons PPA et les échantillons témoins (Tableau supplémentaire 2). L'abondance de 59 espèces dans les échantillons PPA était significativement supérieure à celle des échantillons témoins, tandis que l'abondance de seulement 16 espèces dans les échantillons témoins était supérieure à celle des échantillons PPA (Figure 3).
Figure 3. Abondance différentielle des taxons dans le microbiote intestinal de souris PPA et de souris témoins. Les graphiques en volcan illustrent les différences d'abondance des genres (A) ou des espèces (B) entre les échantillons PPA et témoins. Les points gris indiquent l'absence de différence significative d'abondance des taxons. Les points colorés indiquent des différences d'abondance significatives (p ≤ 0,05). Les 20 taxons présentant les plus grandes différences d'abondance entre les types d'échantillons sont représentés en rouge et en bleu clair (échantillons témoins et PPA, respectivement). Les points jaunes et violets correspondent à des taxons au moins 2,7 fois plus abondants dans les échantillons témoins ou PPA que dans les échantillons témoins. Les points noirs représentent les taxons présentant des différences d'abondance significatives, avec des différences moyennes de CLR comprises entre -1 et 1. Les valeurs p ont été calculées à l'aide du test U de Mann-Whitney et corrigées pour les comparaisons multiples par la méthode de Benjamini-Hochberg. Les différences moyennes de CLR en gras indiquent des différences d'abondance significatives.
Après avoir analysé la composition du microbiote intestinal, nous avons réalisé une annotation fonctionnelle de ce dernier. Après élimination des gènes de faible qualité, 378 355 gènes uniques ont été identifiés dans l’ensemble des échantillons. L’abondance transformée de ces gènes a été utilisée pour une analyse en composantes principales (ACP), et les résultats ont montré un fort regroupement des types d’échantillons en fonction de leurs profils fonctionnels (Figure 4).
Figure 4. Résultats de l'ACP appliquée au profil fonctionnel du microbiote intestinal de la souris. Le graphique de l'ACP illustre la distribution des échantillons selon leurs deux premières composantes principales. Les couleurs indiquent le type d'échantillon : les souris exposées au PPA sont en violet et les souris témoins en jaune. Les composantes principales 1 et 2 sont représentées respectivement sur l'axe des abscisses et l'axe des ordonnées, et sont exprimées en pourcentage de variance expliquée.
Nous avons ensuite examiné l'abondance des gènes KEGG invalidés dans différents types d'échantillons. Au total, 3 648 gènes invalidés uniques ont été identifiés, dont 196 étaient significativement plus abondants dans les échantillons témoins et 106 dans les échantillons PPA (Figure 5). 145 gènes ont été détectés dans les échantillons témoins et 61 dans les échantillons PPA, avec des abondances significativement différentes. Les voies métaboliques liées au métabolisme des lipides et des oses aminés étaient significativement plus enrichies dans les échantillons PPA (Tableau supplémentaire 3). Les voies métaboliques liées au métabolisme de l'azote et aux systèmes de relais du soufre étaient significativement plus enrichies dans les échantillons témoins (Tableau supplémentaire 3). L'abondance des gènes liés au métabolisme des oses aminés/nucléotides (ko :K21279) et au métabolisme des inositol phosphates (ko :K07291) était significativement plus élevée dans les échantillons PPA (Figure 5). Les échantillons témoins contenaient significativement plus de gènes liés au métabolisme du benzoate (ko:K22270), au métabolisme de l'azote (ko:K00368) et à la glycolyse/gluconéogenèse (ko:K00131) ( Figure 5 ).
Figure 5. Abondance différentielle des KO dans le microbiote intestinal de souris PPA et témoins. Le graphique en volcan illustre les différences d'abondance des groupes fonctionnels (KO). Les points gris indiquent les KO dont l'abondance n'est pas significativement différente entre les types d'échantillons (p > 0,05). Les points colorés indiquent des différences d'abondance significatives (p ≤ 0,05). Les 20 KO présentant les plus grandes différences d'abondance entre les types d'échantillons sont représentés en rouge et bleu clair, correspondant respectivement aux échantillons témoins et PPA. Les points jaunes et violets indiquent les KO dont l'abondance est au moins 2,7 fois supérieure dans les échantillons témoins et PPA, respectivement. Les points noirs indiquent les KO présentant des différences d'abondance significatives, avec des différences moyennes de CLR comprises entre -1 et 1. Les valeurs p ont été calculées à l'aide du test U de Mann-Whitney et ajustées pour les comparaisons multiples par la méthode de Benjamini-Hochberg. NaN indique que le KO n'appartient à aucune voie métabolique dans KEGG. Les valeurs moyennes de différence CLR en gras indiquent des différences d'abondance significatives. Pour plus d'informations sur les voies métaboliques auxquelles appartiennent les KO listés, voir le tableau supplémentaire 3.
Parmi les gènes annotés, 1 601 gènes présentaient des abondances significativement différentes entre les types d'échantillons (p ≤ 0,05), chaque gène étant au moins 2,7 fois plus abondant. Parmi ces gènes, 4 étaient plus abondants dans les échantillons témoins et 1 597 dans les échantillons PPA. Le PPA possédant des propriétés antimicrobiennes, nous avons examiné l'abondance des gènes impliqués dans son métabolisme et sa production entre les types d'échantillons. Parmi les 1 332 gènes liés au métabolisme du PPA, 27 étaient significativement plus abondants dans les échantillons témoins et 12 dans les échantillons PPA. Parmi les 223 gènes liés à la production du PPA, un seul était significativement plus abondant dans les échantillons PPA. La figure 6A illustre l'abondance plus élevée des gènes impliqués dans le métabolisme du PPA, avec une abondance significativement plus élevée dans les échantillons témoins et des effets importants, tandis que la figure 6B met en évidence des gènes individuels présentant une abondance significativement plus élevée dans les échantillons PPA.
Figure 6. Abondance différentielle des gènes liés au PPA dans le microbiote intestinal de la souris. Les graphiques en volcan illustrent les différences d'abondance des gènes associés au métabolisme (A) et à la production (B) du PPA. Les points gris indiquent les gènes dont l'abondance n'est pas significativement différente entre les types d'échantillons (p > 0,05). Les points colorés indiquent des différences d'abondance significatives (p ≤ 0,05). Les 20 gènes présentant les plus grandes différences d'abondance sont représentés en rouge et bleu clair (échantillons témoins et PPA, respectivement). L'abondance des points jaunes et violets était au moins 2,7 fois supérieure dans les échantillons témoins et PPA que dans les échantillons témoins. Les points noirs représentent les gènes présentant des différences d'abondance significatives, avec des différences moyennes de CLR comprises entre -1 et 1. Les valeurs p ont été calculées à l'aide du test U de Mann-Whitney et corrigées pour les comparaisons multiples par la méthode de Benjamini-Hochberg. Les gènes correspondent à des gènes représentatifs du catalogue de gènes non redondants. Les noms des gènes sont composés du symbole KEGG désignant un gène KO. Les différences moyennes de CLR en gras indiquent des abondances significativement différentes. Un tiret (-) indique l'absence de symbole pour ce gène dans la base de données KEGG.
Les taxons possédant des gènes liés au métabolisme et/ou à la production de PPA ont été identifiés en faisant correspondre l'identité taxonomique des contigs avec l'identifiant du gène associé. Au niveau du genre, 130 genres présentaient des gènes liés au métabolisme du PPA et 61 genres des gènes liés à sa production (Tableau supplémentaire 4). Cependant, aucune différence d'abondance n'a été observée entre les genres (p > 0,05).
Au niveau de l'espèce, 144 espèces bactériennes possédaient des gènes associés au métabolisme du PPA et 68 espèces bactériennes possédaient des gènes associés à la production de PPA (Tableau supplémentaire 5). Parmi les bactéries métabolisant le PPA, huit ont présenté une augmentation significative de leur abondance entre les différents types d'échantillons, et toutes ont montré des variations significatives de leur effet (Tableau supplémentaire 6). Toutes les bactéries métabolisant le PPA et présentant des différences d'abondance significatives étaient plus abondantes dans les échantillons contenant du PPA. La classification au niveau de l'espèce a révélé des représentants de genres dont l'abondance ne différait pas significativement entre les types d'échantillons, notamment plusieurs espèces de Bacteroides et de Ruminococcus, ainsi que Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus et Alcaligenes polymorpha. Parmi les bactéries productrices de PPA, quatre ont présenté des différences d'abondance significatives entre les types d'échantillons. Les espèces présentant des différences d'abondance significatives comprenaient Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis et Ruminococcus bovis.
Dans cette étude, nous avons examiné les effets de l'exposition au PPA sur le microbiote intestinal de souris. Le PPA peut induire différentes réponses chez les bactéries car il est produit par certaines espèces, utilisé comme source de nourriture par d'autres, ou possède des propriétés antimicrobiennes. Par conséquent, son ajout au microbiote intestinal par supplémentation alimentaire peut avoir des effets variables selon la tolérance, la sensibilité et la capacité à l'utiliser comme source nutritive. Les espèces bactériennes sensibles peuvent être éliminées et remplacées par des espèces plus résistantes au PPA ou capables de l'utiliser comme source de nourriture, entraînant des modifications de la composition du microbiote intestinal. Nos résultats ont révélé des différences significatives dans la composition microbienne, mais aucun effet sur la diversité microbienne globale. Les effets les plus importants ont été observés au niveau des espèces, avec plus de 70 taxons présentant des différences d'abondance significatives entre les échantillons exposés au PPA et les échantillons témoins (Tableau supplémentaire 2). Une analyse plus approfondie de la composition des échantillons exposés au PPA a révélé une plus grande hétérogénéité des espèces microbiennes par rapport aux échantillons non exposés, suggérant que le PPA pourrait favoriser la croissance bactérienne et limiter les populations bactériennes capables de survivre dans des environnements riches en PPA. Ainsi, le PPA pourrait induire des changements de manière sélective plutôt que de provoquer une perturbation généralisée de la diversité du microbiote intestinal.
Il a été démontré que des conservateurs alimentaires comme le PPA modifient l'abondance des composants du microbiote intestinal sans affecter sa diversité globale (Nagpal et al., 2021). Dans cette étude, nous avons observé les différences les plus marquées entre les espèces de Bacteroidetes au sein du phylum Bacteroidetes (anciennement appelé Bacteroidetes), qui étaient significativement plus abondantes chez les souris exposées au PPA. L'augmentation de l'abondance des espèces de Bacteroides est associée à une dégradation accrue du mucus, ce qui peut accroître le risque d'infection et favoriser l'inflammation (Cornick et al., 2015 ; Desai et al., 2016 ; Penzol et al., 2019). Une étude a révélé que des souris mâles nouveau-nées traitées avec Bacteroides fragilis présentaient des comportements sociaux évoquant les troubles du spectre autistique (TSA) (Carmel et al., 2023). D'autres études ont montré que les espèces de Bacteroides peuvent altérer l'activité immunitaire et induire une cardiomyopathie inflammatoire auto-immune (Gil-Cruz et al., 2019). Les espèces appartenant aux genres Ruminococcus, Prevotella et Parabacteroides étaient également significativement plus abondantes chez les souris exposées au PPA (Coretti et al., 2018). Certaines espèces de Ruminococcus sont associées à des maladies comme la maladie de Crohn par la production de cytokines pro-inflammatoires (Henke et al., 2019), tandis que les espèces de Prevotella, telles que Prevotella humani, sont associées à des maladies métaboliques comme l'hypertension et l'insulinorésistance (Pedersen et al., 2016 ; Li et al., 2017). Enfin, nous avons constaté que le rapport Bacteroidetes (anciennement Firmicutes)/Bacteroidetes était significativement plus faible chez les souris exposées au PPA que chez les souris témoins, en raison d'une abondance totale plus élevée d'espèces de Bacteroidetes. Ce rapport s'est révélé être un indicateur important de l'homéostasie intestinale, et ses perturbations ont été associées à diverses pathologies (Turpin et al., 2016 ; Takezawa et al., 2021 ; An et al., 2023), notamment les maladies inflammatoires de l'intestin (Stojanov et al., 2020). Globalement, les espèces du phylum Bacteroidetes semblent être les plus fortement affectées par une concentration élevée de PPA dans l'alimentation. Ceci pourrait être dû à une tolérance accrue au PPA ou à la capacité de l'utiliser comme source d'énergie, ce qui a été démontré pour au moins une espèce, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Par ailleurs, l'exposition maternelle au PPA pourrait améliorer le développement fœtal en rendant l'intestin des souriceaux plus susceptible à la colonisation par les Bacteroidetes ; cependant, notre protocole d'étude ne permettait pas une telle évaluation.
L'analyse métagénomique a révélé des différences significatives dans l'abondance des gènes associés au métabolisme et à la production de PPA. Les souris exposées au PPA présentaient une plus grande abondance de gènes responsables de sa production, tandis que les souris non exposées présentaient une plus grande abondance de gènes responsables de son métabolisme (Figure 6). Ces résultats suggèrent que l'effet du PPA sur la composition microbienne ne serait pas uniquement dû à son utilisation ; autrement, l'abondance des gènes associés à son métabolisme aurait été plus élevée dans le microbiote intestinal des souris exposées. Une explication possible est que le PPA module l'abondance bactérienne principalement par ses effets antimicrobiens plutôt que par son utilisation comme nutriment par les bactéries. Des études antérieures ont montré que le PPA inhibe la croissance de Salmonella Typhimurium de manière dose-dépendante (Jacobson et al., 2018). L'exposition à des concentrations plus élevées de PPA pourrait sélectionner des bactéries résistantes à ses propriétés antimicrobiennes et incapables de le métaboliser ou de le produire. Par exemple, plusieurs espèces de Parabacteroides présentaient une abondance significativement plus élevée dans les échantillons de PPA, mais aucun gène lié au métabolisme ou à la production de PPA n'a été détecté (Tableaux supplémentaires 2, 4 et 5). De plus, la production de PPA comme sous-produit de fermentation est largement répandue chez diverses bactéries (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Une plus grande diversité bactérienne pourrait expliquer l'abondance plus élevée de gènes liés au métabolisme du PPA dans les échantillons témoins (Averina et al., 2020). Par ailleurs, seuls 27 gènes (2,14 %) sur 1 332 étaient prédits comme étant exclusivement associés au métabolisme du PPA. De nombreux gènes associés au métabolisme du PPA sont également impliqués dans d'autres voies métaboliques. Ceci démontre que l'abondance des gènes impliqués dans le métabolisme du PPA était plus élevée dans les échantillons témoins ; ces gènes pourraient fonctionner dans des voies qui ne conduisent pas à l'utilisation ou à la formation de PPA comme sous-produit. Dans ce cas, un seul gène associé à la production de PPA a montré des différences d'abondance significatives entre les types d'échantillons. Contrairement aux gènes associés au métabolisme du PPA, les gènes marqueurs de la production de PPA ont été sélectionnés car ils sont directement impliqués dans la voie métabolique bactérienne de production du PPA. Chez les souris exposées au PPA, toutes les espèces présentaient une augmentation significative de l'abondance et de la capacité de production de PPA. Ceci confirme l'hypothèse selon laquelle les PPA sélectionneraient les souches productrices de PPA et, par conséquent, induirait une augmentation de la capacité de production de PPA. Cependant, l'abondance génique n'est pas nécessairement corrélée à l'expression génique ; ainsi, bien que l'abondance des gènes associés au métabolisme du PPA soit plus élevée dans les échantillons témoins, leur taux d'expression peut différer (Shi et al., 2014). Afin de confirmer la relation entre la prévalence des gènes codant pour les PPA et la production de PPA, des études d'expression des gènes impliqués dans la production de PPA sont nécessaires.
L'annotation fonctionnelle des métagénomes PPA et témoins a révélé certaines différences. L'analyse en composantes principales (ACP) du contenu génique a mis en évidence des groupes distincts entre les échantillons PPA et témoins (Figure 5). Le regroupement intra-échantillon a révélé que le contenu génique des témoins était plus diversifié, tandis que les échantillons PPA étaient regroupés. Le regroupement par contenu génique était comparable au regroupement par composition spécifique. Ainsi, les différences d'abondance des voies métaboliques sont cohérentes avec les variations d'abondance d'espèces et de souches spécifiques au sein de ces voies. Dans les échantillons PPA, deux voies métaboliques présentant une abondance significativement plus élevée étaient liées au métabolisme des aminosucres/nucléotides-sucres (ko:K21279) et à plusieurs voies du métabolisme des lipides (ko:K00647, ko:K03801 ; Tableau supplémentaire 3). Les gènes associés à ko:K21279 sont connus pour être associés au genre Bacteroides, l'un des genres présentant un nombre d'espèces significativement plus élevé dans les échantillons PPA. Cette enzyme peut échapper à la réponse immunitaire en exprimant des polysaccharides capsulaires (Wang et al., 2008). Ceci pourrait expliquer l'augmentation des Bacteroidetes observée chez les souris exposées au PPA. Ce phénomène complète l'augmentation de la synthèse des acides gras observée dans le microbiome exposé au PPA. Les bactéries utilisent la voie FASIIko:K00647 (fabB) pour produire des acides gras, ce qui peut influencer les voies métaboliques de l'hôte (Yao et Rock, 2015 ; Johnson et al., 2020). Les modifications du métabolisme lipidique pourraient jouer un rôle dans le neurodéveloppement (Yu et al., 2020). Une autre voie métabolique dont l'abondance est accrue dans les échantillons exposés au PPA est la biosynthèse des hormones stéroïdiennes (ko:K12343). De plus en plus de données suggèrent une relation inverse entre la capacité du microbiote intestinal à influencer les taux d'hormones et sa capacité à être influencé par ces hormones ; ainsi, des taux élevés de stéroïdes pourraient avoir des conséquences néfastes sur la santé (Tetel et al., 2018).
Cette étude présente certaines limites et considérations. Il est important de noter que nous n'avons pas réalisé d'évaluations physiologiques chez les animaux. Par conséquent, il est impossible de conclure directement à une association entre les modifications du microbiome et une quelconque maladie. De plus, les souris de cette étude ont reçu le même régime alimentaire que leurs mères. Des études ultérieures pourraient déterminer si le passage d'un régime riche en PPA à un régime sans PPA améliore ses effets sur le microbiome. Comme pour beaucoup d'autres études, la taille réduite de l'échantillon constitue une limite de notre étude. Bien que des conclusions valides puissent être tirées, un échantillon plus important permettrait une plus grande puissance statistique lors de l'analyse des résultats. Nous restons également prudents quant à l'interprétation d'une association entre les modifications du microbiome intestinal et une quelconque maladie (Yap et al., 2021). Des facteurs de confusion tels que l'âge, le sexe et le régime alimentaire peuvent influencer significativement la composition des micro-organismes. Ces facteurs pourraient expliquer les incohérences observées dans la littérature concernant l'association du microbiome intestinal avec les maladies complexes (Johnson et al., 2019 ; Lagod et Naser, 2023). Par exemple, il a été montré que les membres du genre Bacteroidetes étaient soit augmentés, soit diminués chez les animaux et les humains atteints de TSA (Angelis et al., 2013 ; Kushak et al., 2017). De même, des études sur la composition intestinale chez les patients atteints de maladies inflammatoires de l’intestin ont révélé des augmentations et des diminutions des mêmes taxons (Walters et al., 2014 ; Forbes et al., 2018 ; Upadhyay et al., 2023). Afin de limiter l’impact des biais liés au sexe, nous avons veillé à assurer une représentation égale des deux sexes, de sorte que les différences observées soient très probablement dues à l’alimentation. L’une des difficultés de l’annotation fonctionnelle réside dans l’élimination des séquences géniques redondantes. Notre méthode de regroupement de gènes exige une identité de séquence de 95 % et une similarité de longueur de 85 %, ainsi qu’une couverture d’alignement de 90 % afin d’éliminer les faux regroupements. Cependant, dans certains cas, nous avons observé des COG avec les mêmes annotations (par exemple, MUT) (Fig. 6). Des études complémentaires sont nécessaires pour déterminer si ces orthologues sont distincts, associés à des genres spécifiques, ou s'il s'agit d'une limitation de l'approche de regroupement de gènes. Une autre limite de l'annotation fonctionnelle est le risque d'erreur de classification ; le gène bactérien mmdA code pour une enzyme connue impliquée dans la synthèse du propionate, mais KEGG ne l'associe pas à la voie métabolique du propionate. En revanche, les orthologues scpB et mmcD sont apparentés. Le grand nombre de gènes sans invalidation génique spécifique peut empêcher l'identification des gènes liés à la PPA lors de l'évaluation de l'abondance génique. Les études futures bénéficieront de l'analyse du métatranscriptome, qui permettra une meilleure compréhension des caractéristiques fonctionnelles du microbiote intestinal et établira un lien entre l'expression génique et les effets potentiels en aval. Pour les études portant sur des troubles neurodéveloppementaux spécifiques ou des maladies inflammatoires de l'intestin, des évaluations physiologiques et comportementales chez l'animal sont nécessaires pour établir un lien entre les modifications de la composition du microbiome et ces troubles. Des études complémentaires, consistant à transplanter le microbiome intestinal chez des souris axéniques, seraient également utiles pour déterminer si le microbiome est un facteur déterminant ou une caractéristique de la maladie.
En résumé, nous avons démontré que le PPA alimentaire influence la composition du microbiote intestinal. Le PPA est un conservateur approuvé par la FDA, largement présent dans divers aliments, qui, en cas d'exposition prolongée, peut perturber la flore intestinale normale. Nous avons observé des variations de l'abondance de plusieurs bactéries, suggérant que le PPA peut modifier la composition du microbiote intestinal. Ces modifications peuvent entraîner des variations des niveaux de certaines voies métaboliques, induisant ainsi des changements physiologiques importants pour la santé de l'hôte. Des études complémentaires sont nécessaires pour déterminer si les effets du PPA alimentaire sur la composition microbienne peuvent conduire à une dysbiose ou à d'autres maladies. Cette étude jette les bases de futures recherches sur l'impact potentiel du PPA sur la composition intestinale et la santé humaine.
Les jeux de données présentés dans cette étude sont disponibles dans des dépôts en ligne. Le nom du dépôt et le numéro d'accès sont : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Cette étude animale a été approuvée par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Floride centrale (UCF-IACUC) (Numéro d'autorisation d'utilisation des animaux : PROTO202000002). Cette étude est conforme aux lois, réglementations et exigences institutionnelles locales.
NG : Conceptualisation, curation des données, analyse formelle, investigation, méthodologie, logiciel, visualisation, rédaction (première version), rédaction (révision et correction). LA : Conceptualisation, curation des données, méthodologie, ressources, rédaction (révision et correction). SH : Analyse formelle, logiciel, rédaction (révision et correction). SA : Investigation, rédaction (révision et correction). Juge en chef : Investigation, rédaction (révision et correction). SN : Conceptualisation, gestion de projet, ressources, supervision, rédaction (révision et correction). TA : Conceptualisation, gestion de projet, supervision, rédaction (révision et correction).
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Date de publication : 18 avril 2025