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Contrairement aux vertébrés, on pense généralement que les insectes sont dépourvus d'hormones stéroïdiennes sexuelles à prédominance masculine. Chez Anopheles gambiae, l'ecdysone 20-hydroxyecdysone (20E) semble avoir évolué pour contrôler le développement des œufs lorsqu'elle est synthétisée par les femelles² et pour induire une période réfractaire à l'accouplement lorsqu'elle est transmise sexuellement par les mâles³. Le développement des œufs et l'accouplement étant des fonctions reproductives essentielles, comprendre comment les moustiques Anopheles femelles intègrent ces signaux hormonaux pourrait faciliter la conception de nouveaux programmes de lutte contre le paludisme. Nous révélons ici que ces fonctions reproductives sont régulées par des stéroïdes sexuels distincts via un réseau complexe d'enzymes activant/inactivant les ecdystéroïdes. Nous avons identifié une ecdysone oxydée spécifique aux mâles, la 3-déshydro-20E (3D20E), qui protège la filiation en inhibant la réceptivité sexuelle des femelles après transfert sexuel et activation par déphosphorylation. Notamment, le transfert de 3D20E a également induit l'expression de gènes de reproduction qui maintiennent le développement des œufs pendant l'infection par Plasmodium. L'infection, et notamment la 20E, assure la santé des femelles infectées. La 20E d'origine femelle ne provoque pas de réponse sexuelle, mais permet aux individus en âge de s'accoupler de pondre des œufs après l'inhibition des kinases inhibitrices de la 20E. L'identification de cette hormone stéroïdienne spécifique aux mâles chez les insectes et son rôle dans la régulation de la réceptivité sexuelle, de la fertilité et de l'interaction avec Plasmodium chez les femelles suggèrent la possibilité de réduire le succès reproductif des moustiques vecteurs du paludisme.
Les cas et les décès liés au paludisme sont à nouveau en hausse4 en raison de la résistance généralisée aux insecticides chez les moustiques Anopheles, le seul vecteur des parasites du paludisme humain. La biologie de l'accouplement de ces moustiques est une cible particulièrement intéressante pour de nouvelles interventions de lutte contre le paludisme, car les femelles ne s'accouplent qu'une seule fois5 ; rendre cet unique événement d'accouplement stérile aurait un grand potentiel pour réduire les populations de moustiques sur le terrain.
Les femmes deviennent sexuellement incapables après avoir reçu de fortes doses d'hormones stéroïdiennes de la part d'hommes. Des études ont montré que le facteur déclenchant les difficultés d'accouplement ultérieures est la 20-hydroxyecdysone (20E), une hormone stéroïdienne mieux connue pour son rôle dans la régulation du cycle de mue au stade larvaire. La capacité des mâles à synthétiser et à transférer la 20E a évolué spécifiquement chez les espèces d'Anopheles appartenant au sous-genre Cellia7, présent en Afrique et comprenant les vecteurs les plus dangereux du paludisme, notamment Anopheles gambiae. Ceci est particulièrement remarquable car, chez ces espèces, les femelles produisent également de la 20E après chaque repas de sang, et cette hormone est essentielle au cycle d'ovogenèse (voir réf. 8). Cependant, on ignore encore comment les femelles intègrent les signaux provenant de deux sources différentes d'ecdysone (transfert mâle et induction par le repas de sang) sans compromettre leur propre capacité à s'accoupler. En effet, si la 20E produite par les femelles induit une intolérance sexuelle, cela peut entraîner… l’infertilité chez les individus qui nourrissent des femelles vierges, un comportement très courant chez ces moustiques5.
Une explication possible est que les mâles d'A. gambiae transfèrent une ecdysone modifiée spécifique aux mâles, qui active une cascade de signalisation dans l'appareil reproducteur femelle, entraînant une instabilité de l'accouplement. Cependant, bien que les vertébrés possèdent de multiples hormones stéroïdiennes, telles que les œstrogènes et les androgènes (revu dans la réf. 9), à notre connaissance, aucun stéroïde à prédominance androgénique n'a été identifié chez les insectes.
Nous avons entrepris de déterminer le répertoire des hormones stéroïdiennes dans la glande accessoire mâle (GAM) d'A. gambiae sexuellement matures, afin d'identifier d'éventuels stéroïdes modificateurs. L'utilisation de la chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem (CLHP-SM/SM), contrairement à la méthode moins spécifique utilisée précédemment, nous a permis de détecter l'ecdysone (E) et la 20E dans ce tissu, confirmant ainsi des résultats antérieurs. Cependant, l'échantillon était principalement composé de stéroïdes phosphorylés oxydés, correspondant à la formule 3-déshydro-20E-22-phosphate (3D20E22P)¹² (Figure 1). Parmi les autres formes présentes, on trouve la 3-déshydro-20E (3D20E) et la 20E-22-phosphate (20E22P). L'intensité du signal CLHP-SM/SM de la 3D20E22P était deux ordres de grandeur supérieure à celle de sa forme déphosphorylée, la 3D20E, et trois ordres de grandeur supérieure à celle de l'E et de la 20E. 20E (Figure 1). Bien que présent dans d'autres parties du corps et dans l'appareil reproducteur inférieur (ARI ; Fig. 1a des données complémentaires). Nous avons également analysé les ecdystéroïdes chez des mâles et des femelles récemment fermés (< 1 jour) et détecté 3D20E et 3D20E22P uniquement dans les glandes mammaires (GM) ; E, 20E et 20E22P étaient présents chez les deux sexes (Fig. 1b des données complémentaires). Ces données suggèrent que les mâles adultes d'A. gambiae produisent des taux élevés d'hormones modificatrices dans leurs GM, qui ne sont pas synthétisées par les femelles.
Les organes reproducteurs masculins (MAG) et les voies respiratoires inférieures (LRT) femelles (comprenant les oreillettes, les vésicules séminales et le parovarium) ont été disséqués chez des mâles vierges âgés de 4 jours et chez des femelles vierges et accouplées (0,5, 3 et 12 heures après l'accouplement). L'ecdysone présente dans ces tissus a été analysée par HPLC-MS/MS (moyenne ± erreur standard à la moyenne ; test t non apparié, bilatéral, corrigé pour le taux de faux positifs [FDR] ; NS : non significatif ; *P < 0,05, **P < 0,01). 3D20E : 3 heures vs 0,5 heure, P = 0,035 ; 12 heures vs 3 heures, P = 0,0015 ; 12 heures vs 0,5 heure, P = 0,030. 3D20E22P : 3 heures vs 0,5 heure, P = 0,25 ; 12 heures vs 3 heures, P = 0,0015. P = 0,0032 ; 12 heures contre 0,5 heure, P = 0,015. Les données proviennent de trois réplicats biologiques. L’aire du pic pour chaque ecdysone d’intérêt a été calculée et normalisée par le nombre de moustiques. L’ecdysone est représentée par une couleur : E, vert ; 20E, orange ; 20E22P, violet ; 3D20E, bleu ; 3D20E22P, rose. L’encart augmente l’échelle de l’axe des ordonnées pour indiquer les concentrations d’ecdysone les plus faibles.
Afin d'étudier le transfert de 3D20E22P et de 3D20E lors de l'accouplement, nous avons disséqué les vaisseaux lymphatiques lombaires (VLL) de femelles à différents moments après l'accouplement. Bien que l'ecdysone soit absente chez les femelles vierges, nous avons observé des quantités importantes de 3D20E22P dans les VLL immédiatement après l'accouplement (0,5 h post-accouplement), ces quantités diminuant avec le temps, tandis que les niveaux de 3D20E augmentaient significativement (Fig. 1). En utilisant du 3D20E de synthèse comme étalon, nous avons déterminé que les niveaux de cette hormone stéroïdienne dans les VLL après l'accouplement étaient au moins 100 fois supérieurs à ceux du 3D20E (Tableau 1 des données complémentaires). Ainsi, le 3D20E22P est la principale ecdysone mâle transférée aux VLL femelles lors de l'accouplement, et sa forme déphosphorylée, le 3D20E, devient très abondante peu après l'accouplement. Ceci suggère un rôle important de cette dernière ecdysone dans la biologie post-accouplement chez la femelle.
Après avoir généré un nouveau jeu de données de séquençage d'ARN (RNA-seq) (Fig. 2a) à l'aide d'un pipeline bioinformatique personnalisé, nous avons recherché l'ecdysone kinase (EcK), l'ecdysone oxydase (EO) et le gène codant pour la phosphatase modifiée par le 20E de l'ecdysone (EPP). L'EPP est exprimée dans les tissus reproducteurs. Nous avons identifié un gène EPP candidat et deux gènes EcK potentiels (EcK1 et EcK2), mais aucun gène EO candidat satisfaisant. Notamment, les gènes EPP individuels étaient fortement exprimés (98,9e percentile) dans les glandes mammaires mâles (MAG) gambiennes, mais pas dans les organes reproducteurs génitaux (LRT) femelles (Fig. 2b), contrairement à nos attentes puisque la déphosphorylation du 3D20E22P a été observée dans ce tissu femelle. Par conséquent, nous pensons que l'EPP mâle pourrait être transférée lors de l'accouplement. En effet, nous avons utilisé un marquage isotopique stable in vivo pour masquer la protéine femelle après l'accouplement, une enzyme identifiée par spectrométrie de masse (MS). dans l'atrium femelle (Fig. 2c et tableau supplémentaire 1). La présence d'EPP dans le MAG et le LRT femelle accouplée (mais pas vierge) a également été confirmée à l'aide d'anticorps spécifiques (Fig. 2d).
a) Un pipeline bioinformatique personnalisé a été développé pour rechercher, dans les tissus reproducteurs de chaque sexe, les gènes codant pour les EcK, les EO et les EPP. Les chiffres à côté des flèches indiquent le nombre de candidats mâles et femelles à chaque étape. Cette analyse a identifié un gène EPP (EPP) et un gène EcK (EcK1) exprimés chez les mâles, ainsi qu'un gène EcK (EcK2) exprimé chez les deux sexes, mais ne correspondant pas à un gène EO candidat. b) Carte thermique comparant l'expression des gènes candidats dans les tissus vierges (V) et en cours d'accouplement (M) d'Anopheles gambiae et d'Anopheles albicans. Spca : fécondation ; MAG : glandes accessoires chez les mâles. D'autres parties du corps, notamment les seins, les ailes, les pattes, les corps gras et les organes internes chez les deux sexes, ainsi que les ovaires chez les femelles, sont concernées. EcK2 est fortement exprimé dans le MAG et les oreillettes de Gambie, tandis qu'EPP est présent uniquement dans le MAG. c, Analyse protéomique de la translocation du groupe éjaculatoire mâle dans les oreillettes femelles à 3, 12 et 24 hpm, montrant les 67 protéines les plus abondantes. Les femelles ont été élevées avec un régime alimentaire contenant du 15N pour marquer (et masquer) toutes les protéines. Des mâles non marqués ont été accouplés avec des femelles marquées, et les LRT femelles ont été disséqués à 3, 12 et 24 hpm pour l'analyse protéomique (voir le tableau supplémentaire 1 pour une liste complète des protéines éjaculatoires). Encart : EPP, Eck1 et EcK2 ont été détectés dans le MAG de mâles vierges par analyse protéomique de ces tissus. d, EPP a été détecté par western blot dans le MAG et le LRT de femelles accouplées, mais pas Chez les femelles ou les mâles vierges, ou dans le reste du corps féminin, les membranes ont été simultanément incubées avec des anticorps anti-actine (contrôle de charge) et anti-EPP. Tous les mâles sont vierges. Voir la figure supplémentaire 1 pour les données de la source du gel. Les western blots ont été réalisés deux fois avec des résultats similaires.
L'activité phosphophosphatase de l'ecdystéroïde de l'EPP a été vérifiée après incubation par HPLC-MS/MS avec la protéine 3D20E22P isolée de MAG (Figure supplémentaire 2a). De plus, l'inhibition de l'expression de l'EPP par interférence ARN (ARNi) a entraîné une forte réduction de l'activité phosphatase dans les tissus reproducteurs de ces mâles (Figure 3a). Les femelles accouplées à des mâles dont l'expression de l'EPP était inhibée présentaient une proportion significativement plus faible de 3D20E déphosphorylée (Figure 3b), malgré une inhibition partielle du gène (Figures supplémentaires 2b et 2c). En revanche, aucune variation significative du rapport 20E22P/20E n'a été observée chez ces mêmes moustiques, ce qui suggère que l'enzyme est spécifique de la protéine 3D20E22P (Figure 3b).
a) Diminution de l'activité phosphatase dans les MAG induite par l'inhibition de l'EPP à l'aide d'ARN double brin d'EPP (dsEPP) ou d'ARN double brin de GFP (dsGFP) comme témoins. Vingt pools de MAG ont été utilisés dans chaque réplicat (P = 0,0046, test t apparié bilatéral), représentés par des points distincts. b) Les femelles accouplées avec des mâles dont l'EPP était inhibé présentaient une proportion significativement plus faible de 3D20E déphosphorylée à 3 hpm (P = 0,0043, test t non apparié bilatéral), tandis que les niveaux de 20E restaient inchangés (P = 0,063, non apparié). Test t, bilatéral). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM) à partir de trois groupes de 13, 16 et 19 femelles chacun.c, Les femelles accouplées avec des mâles dont l'EPP était inhibé avaient des taux de réaccouplement significativement plus élevés (P = 0,0002, test exact de Fisher, bilatéral). Les femelles ont d'abord été forcées de s'accoupler pour assurer leur statut d'accouplement ; Deux jours plus tard, les femelles ont été mises en contact avec d'autres mâles porteurs de sperme transgénique afin d'évaluer les taux de réaccouplement par détection quantitative du transgène par PCR. Les femelles gorgées de sang et accouplées avec des mâles dont l'expression d'EPP était inhibée présentaient une fertilité significativement réduite (P < 0,0001 ; test de Mann-Whitney bilatéral) et un nombre d'œufs légèrement réduit (P = 0,088 ; test de Mann-Whitney bilatéral), tandis que le taux de ponte n'était pas affecté (P = 0,94 ; test exact de Fisher bilatéral). Dans tous les graphiques, n représente le nombre d'échantillons de moustiques biologiquement indépendants. NS : non significatif. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Nous avons ensuite évalué si la déphosphorylation de l'ecdysone est importante pour induire une résistance à l'accouplement chez les femelles. Notamment, les femelles accouplées avec des mâles dépourvus d'EPP se sont réaccouplées beaucoup plus fréquemment (44,9 %) que les femelles témoins (10,4 %) lorsqu'elles étaient exposées à d'autres mâles (transgéniques) (Fig. 3c). Nous avons également observé une diminution significative de la fertilité (Fig. 3d, gauche) et une légère diminution du nombre d'œufs pondus par ces femelles (Fig. 3d, milieu), tandis que le pourcentage d'œufs pondus (une autre réponse induite chez les femelles par l'accouplement) n'était pas affecté (Fig. 3d, droite). Compte tenu de la spécificité observée de l'EPP pour 3D20E22P, ces résultats suggèrent que l'activation de 3D20E par l'EPP transférée lors de l'accouplement pourrait jouer un rôle important dans l'inhibition de la réceptivité des femelles à un nouvel accouplement, un comportement précédemment attribué au transfert sexuel de 20E. Par conséquent, cette hormone spécifique aux mâles… Elle affecte également fortement la fertilité féminine.
Ensuite, nous avons comparé les activités du 20E et du 3D20E dans des expériences d'injection chez des vierges sexuellement matures en utilisant du 3D20E synthétisé chimiquement (Fig. 4a–c) et du 20E disponible dans le commerce. Nous avons observé que le 3D20E était significativement plus efficace que le 20E pour supprimer la sensibilité des femelles à l'accouplement aux deux concentrations (Fig. 4d). Notamment, la moitié du niveau physiologique de 3D20E dans le LRT (1 066 pg après injection contre 2 022 pg après accouplement) a induit une proportion de femelles réfractaires 20 fois supérieure au niveau physiologique du 20E (361 pg après injection) 24 heures après l'injection à la concentration la plus élevée de 18 pg après accouplement ; (Tableau de données étendu 1). Ce résultat confirme l'hypothèse selon laquelle le transfert sexuel de 20E n'entraîne pas de périodes réfractaires à l'accouplement et indique par ailleurs que 3D20E est un facteur majeur pour assurer la relation parent-enfant. 3D20E était également significativement plus actif que 20E lors des tests de ponte chez les femelles vierges (Fig. 4e), ce qui suggère que le taux de ponte normal observé après l'inhibition partielle d'EPP était dû à la présence d'une activité résiduelle de 3D20E encore produite par des facteurs femelles induits par l'accouplement.
(a, b) 3D20E synthétisé chimiquement à partir de 20E (a) avec un taux de conversion/efficacité très élevé (données présentées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne à partir de trois réactions de synthèse indépendantes) (b). c, Le spectre de masse (partie inférieure) correspond exactement à l'ecdysone trouvée dans le LRT de femelles accouplées (partie supérieure). d, Comparé à 20E (0,63 µg, P = 0,02 ; 0,21 µg, P < 0,0001 ; test exact de Fisher, bilatéral) et à 10 % d'éthanol (0,63 µg, P < 0,0001 ; 0,21 µg, P < 0,0001 ; test exact de Fisher, bilatéral), alors que 20E était significativement plus élevé que le contrôle uniquement aux doses les plus élevées (0,63 µg, P = 0,0002 ; 0,21 µg, P = 0,54 ; Test exact de Fisher (bilatéral). L'injection de 3D20E a induit des taux de ponte significativement plus élevés chez les femelles vierges que les témoins à 10 % d'éthanol (0,21 µg, p < 0,0001 ; 0,13 µg, p = 0,0003 ; test exact de Fisher, bilatéral), tandis que l'injection de 20E, comparée aux témoins, n'a induit de taux de ponte significativement plus élevés qu'aux doses plus élevées (0,21 µg, p = 0,022 ; 0,13 µg, p = 0,0823 ; test exact de Fisher, bilatéral). À doses plus élevées, 3D20E a induit des taux de ponte significativement plus élevés que 20E (0,21 µg, p = 0,0019 ; 0,13 µg, p = 0,075 ; test exact de Fisher, bilatéral). Dans tous les graphiques, n représente le nombre d'échantillons de moustiques biologiquement indépendants. NS : non significatif. *p < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Les données proviennent de trois réplicats.
Dans des études précédentes, nous avons déterminé que le transfert sexuel d'hormones stéroïdiennes induit l'expression de MISO (Stimulant de l'ovogenèse induit par l'accouplement 11), un gène de reproduction femelle qui protège les femelles d'Anopheles gambiae des coûts sanitaires liés à l'infection par Plasmodium falciparum 13, le parasite du paludisme humain le plus mortel. Compte tenu de l'importance de MISO pour la capacité de reproduction d'Anopheles dans les zones d'endémie palustre, nous avons décidé de déterminer quelle hormone, 3D20E ou 20E, déclenche l'expression de ce gène. Nous avons constaté que si l'injection de 20E induit spécifiquement ou plus fortement certains récepteurs hormonaux nucléaires (HR), tels que HR3 et HR4, et des cibles stéroïdiennes en aval typiques, telles que les gènes yolkogènes Vg14, 15 et 16, MISO est plus fortement induit par 3D20E (Figure 3 des données étendues). Ainsi, le transfert sexuel de cette hormone stéroïdienne androgénique semble induire des mécanismes qui protègent les femelles des coûts sanitaires liés à l'infection par Plasmodium falciparum. L’infection parasitaire est un facteur à prendre en compte. De plus, 3D20E affecte différemment les deux isoformes du récepteur EcR, induisant EcR-A et réprimant EcR-B, et activant plus fortement d’autres gènes inducteurs de l’accouplement, notamment HPX15, qui influence la fertilité des femelles. Ceci pourrait expliquer l’infertilité significative observée chez les femelles accouplées à des mâles dont l’expression d’EPP a été inhibée (Figure supplémentaire 3). Ces données suggèrent l’existence de voies de signalisation en aval, activées préférentiellement par deux hormones ecdysones, qui pourraient sous-tendre une fonction spécifique au sexe.
Nous avons ensuite testé la fonction des deux gènes EcK identifiés par notre analyse bioinformatique. L'inhibition d'EcK1 ou d'EcK2 a entraîné une mortalité significative chez les mâles (Figure supplémentaire 4a), suggérant que la phosphorylation de l'ecdysone, et donc son inactivation, est importante pour la survie. Comme EcK2 était exprimé à des niveaux supérieurs à ceux d'EcK1 et a été détecté dans les MAG par protéomique (Figures 2b et 2c et Tableau supplémentaire 2), nous avons validé son activité d'ecdystéroïde kinase en l'incubant avec le 20E, ce qui a conduit à la phosphorylation du 20E22P (Figure supplémentaire 2b). En utilisant le 3D20E comme substrat, nous n'avons pas pu détecter le produit phosphorylé 3D20E22P (Figure supplémentaire 4c), suggérant que le 20E, plutôt que le 3D20E, serait la cible privilégiée d'EcK2.
D'après notre analyse RNA-seq, EcK2 était également fortement exprimé dans le tractus génital latéral (LRT) des femelles vierges, où son expression était inhibée après l'accouplement (Fig. 2b). Nous avons confirmé ces données et déterminé que l'expression d'EcK2 n'était pas affectée par l'ingestion de sang (Fig. 5a des données supplémentaires). En étendant nos expériences initiales de spectrométrie de masse (MS), nous avons déterminé que le pic de 20E22P était étroitement lié au pic de 20E (22 à 26 heures après le repas sanguin ; Fig. 5b des données supplémentaires). L'inhibition d'EcK2 chez les femelles vierges a entraîné une augmentation de trois fois du rapport relatif 20E/20E22P 26 heures après le repas sanguin (Fig. 2c et 5c des données supplémentaires), confirmant qu'EcK2 phosphoryle également 20E chez les femelles. Notamment, les femelles vierges dépourvues d'EcK2 ont conservé une réceptivité sexuelle complète (Fig. 5d et 5e des données supplémentaires), suggérant en outre que la production de 20E par les femelles n'induit pas l'accouplement. Périodes réfractaires à l'accouplement. Cependant, ces femelles présentaient des taux de ponte significativement plus élevés que les témoins, avec plus de 30 % des vierges pondant des œufs (Figure 5f des données complémentaires). Si des injections d'ARN double brin Eck2 (dsEcK2) étaient réalisées après la prise de sang, la ponte n'avait pas lieu, le pic de 20E dû à l'ingestion de sang ayant alors diminué. Globalement, ces résultats soutiennent un modèle selon lequel la 20E produite après la prise de sang peut induire la ponte, mais seulement lorsque le blocage de la ponte (EcK2 et possiblement d'autres facteurs) est levé par l'accouplement. Ni les injections de 20E ni celles de 3D20E n'ont inhibé l'expression d'EcK2 chez les vierges (Figure 5g des données complémentaires), suggérant que d'autres facteurs interviennent dans l'inhibition de cette kinase. Cependant, les niveaux de 20E après la prise de sang n'étaient pas suffisants pour induire une gêne à l'accouplement, mais étaient efficacement déclenchés par des titres élevés de 3D20E transféré sexuellement.
Nos résultats apportent un éclairage important sur les mécanismes régulant le succès reproductif d'A. gambiae. Un modèle a émergé selon lequel les mâles ont évolué pour synthétiser de fortes concentrations de 3D20E, une ecdysone modifiée spécifique aux mâles qui assure la filiation en désensibilisant les femelles à tout nouvel accouplement. Parallèlement, ces vecteurs du paludisme ont également développé un système efficace pour activer la 3D20E chez les femelles en réponse au transfert sexuel d'EPP spécifique aux mâles. À notre connaissance, il s'agit du premier exemple d'un système hormonal stéroïdien à dominance mâle et femelle remplissant une fonction unique et cruciale chez les insectes. La fonction spécifique à l'ecdysone chez les mâles a été postulée mais non démontrée de manière définitive. Par exemple, une hypothèse largement réfutée¹⁸ suggère que ces fonctions pourraient être assurées par le précurseur de la 20E, l'E1. Il est bien établi que chez la drosophile, la monandrie est déclenchée par le transfert sexuel de petits peptides sexuels^19,20 qui interagissent avec les neurones innervant l'appareil reproducteur femelle via un peptide sexuel spécifique. récepteurs21,22.Des travaux supplémentaires sont nécessaires pour déterminer les cascades de signalisation en aval contrôlées par 3D20E chez les femelles d'A. gambiae et pour déterminer si ces cascades peuvent être conservées entre les moustiques et la drosophile.
Étant donné le rôle important de la 3D20E sur la fertilité et le comportement des femelles, mis en évidence dans notre étude, les voies de synthèse et d'activation de la 3D20E offrent de nouvelles perspectives pour les futures stratégies de lutte contre les moustiques. Ces perspectives incluent la génération de mâles stériles compétitifs dans le cadre de stratégies de stérilisation des insectes, leur utilisation pour le lâcher en milieu naturel ou pour imiter la 3D20E lors des jeux de reproduction. La fonction spécifique aux mâles de la 3D20E pourrait avoir évolué lorsque Anopheles gambiae et d'autres espèces de Cellia ont acquis la capacité de coaguler leur sperme en bouchons copulatoires, permettant ainsi le transfert efficace d'un grand nombre d'hormones et d'enzymes activatrices d'hormones. En retour, l'évolution de la 3D20E, induisant la monandrie, fournit aux femelles un mécanisme (via une forte expression de MISO) leur permettant de favoriser leur succès reproductif dans les zones à forte prévalence du paludisme, contribuant ainsi indirectement à la transmission de Plasmodium. Étant donné que la 20E femelle a démontré des effets profonds sur la survie et la croissance de P. falciparum chez les moustiques Anopheles femelles, les hormones stéroïdiennes mâles et femelles sont impliquées dans la reproduction. Les voies de signalisation sont désormais des aspects clés des interactions moustiques-parasites.
Les souches d’A. gambiae G3 ont été élevées dans des conditions d’élevage standard (26-28 °C, 65-80 % d’humidité relative, photopériode 12 h/12 ​​h). Les larves ont été nourries avec un aliment en poudre pour poissons (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets et Tetra Pond Sticks dans un rapport 7:7:2). Les moustiques adultes ont été nourris ad libitum avec une solution de dextrose à 10 % et ont reçu du sang humain chaque semaine (composants sanguins pour l’étude). Les moustiques vierges ont été obtenus en séparant les mâles et les femelles au stade nymphal après examen microscopique des extrémités. Les mâles porteurs du transgène DsRed ont été décrits précédemment.
Des expériences d'accouplement forcé ont été réalisées selon des protocoles précédemment décrits. Pour l'accouplement naturel, des femelles vierges âgées de 4 jours ont été maintenues dans un rapport de 1:3 avec des mâles vierges sexuellement matures pendant deux nuits. Pour les expériences dans lesquelles les mâles ont reçu une injection de dsEPP, la co-cage a coïncidé avec les jours 3 à 4 après l'injection, lorsque l'activité de la phosphatase était maximalement réduite (Fig. 2b des données étendues).
Les tissus de moustiques, les restes de cadavres ou les corps entiers ont été disséqués dans du méthanol pur et homogénéisés à l'aide d'un broyeur à billes (billes de verre de 2 mm, 2 400 tr/min, 90 s). Les quantités de tissus et les volumes de méthanol étaient les suivants : restes de cadavres, 50 µl dans 1 000 µl ; MAG, 50 à 100 µl dans 80 µl ; LRT femelles, 25 à 50 µl dans 80 µl. Le précipité a été soumis à une seconde extraction au méthanol avec le même volume de méthanol. Les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation. Le méthanol des deux extractions a été combiné et séché sous flux d'azote, puis remis en suspension dans les volumes suivants de méthanol à 80 % dans l'eau : restes de cadavres, 50 µl ; MAG et LRT femelles, 30 µl.
Les échantillons ont été analysés par spectrométrie de masse (ID-X, Thermo Fisher) couplée à un système de chromatographie liquide (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl d'échantillon ont été injectés sur une colonne de 3 µm, 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) maintenue à 25 °C. Les phases mobiles pour la chromatographie liquide étaient A (eau, 0,1 % d'acide formique) et B (acétonitrile, 0,1 % d'acide formique). Le gradient de chromatographie liquide était le suivant : 5 % de B pendant 1 minute, puis augmentation à 100 % de B en 11 minutes. Après 8 minutes à 100 %, la colonne a été rééquilibrée à 5 % de B pendant 4 minutes. Le débit était de 0,3 ml/min. L'ionisation dans la source de spectrométrie de masse a été réalisée par ionisation par électrospray à chaud en modes positif et négatif.
Le spectromètre de masse mesure les données dans la gamme m/z de 350 à 680 avec une résolution de 60 000 en mode MS complet. Les données MS/MS ont été acquises sur [M + H]+ (toutes les cibles), [M - H2O + H]+ (toutes les cibles) et [M - H]- (cibles phosphorylées). Ces données ont permis de confirmer les propriétés d'ecdysone des cibles pour lesquelles aucun étalon n'était disponible. Afin d'identifier les ecdystéroïdes non ciblés, les données MS/MS de tous les pics HPLC présentant une abondance relative > 15 % ont été analysées. La quantification a été réalisée à l'aide de courbes d'étalonnage établies à partir d'étalons purs (20E, 3D20E) pour calculer les quantités absolues ou les dilutions d'un échantillon spécifique (toutes les autres cibles) afin de calculer leur équivalence aux quantités présentes chez un mâle. Pour 3D20E, la quantification a été effectuée en utilisant la somme des adduits suivants : [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + Les données ont été extraites et quantifiées à l'aide de Tracefinder (version 4.1). Les données MS/MS ont été analysées à l'aide de Xcalibur (version 4.4). Les spectres MS de E, 20E et 3D20E ont été comparés aux standards respectifs. 3D20E22P a été analysé par dérivatisation avec le réactif de Girard. 20E22P a été analysé par rapport m/z.
Le composé 3D20E22P a été purifié à partir de MAG. La purification a été réalisée à l'échelle analytique par chromatographie liquide ultra-performante (Acquity, Waters) couplée à un détecteur de masse quadripolaire (QDa, Acquity, Waters), dans les mêmes conditions LC que celles utilisées pour l'analyse HPLC-MS/MS. La collecte des fractions a été déclenchée par la détection du rapport masse/charge (m/z) correspondant à 3D20E22P au temps de rétention précédemment déterminé. La pureté des composés extraits a ensuite été vérifiée par HPLC-MS/MS, comme décrit précédemment.
L'ARN total a été extrait de 10 à 12 tissus reproducteurs ou autres parties du corps (sans tête) à l'aide du réactif TRI (Thermo Fisher) selon les instructions du fabricant. L'ARN a ensuite été traité à la TURBO DNase (Thermo Fisher). L'ADNc a été synthétisé à l'aide de la transcriptase inverse du virus de la leucémie murine de Moloney (M-MLV RT ; Thermo Fisher) selon les instructions du fabricant. Les amorces pour la RT-qPCR (Tableau 2 des données complémentaires) ont été décrites précédemment²⁴ ou conçues à l'aide de Primer-BLAST²⁶, en privilégiant les produits de 70 à 150 pb couvrant les jonctions exon-exon ou les paires d'amorces séparant les exons. Les échantillons d'ADNc provenant de trois à quatre réplicats biologiques ont été dilués quatre fois dans de l'eau pour la RT-qPCR. La quantification a été réalisée dans des réactions de 15 µl contenant 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), les amorces et 5 µl d'ADNc dilué. Les réactions d'ADNc ont été réalisées sur un système de PCR en temps réel QuantStudio 6 Pro (Thermo Fisher) et les données ont été collectées et analysées à l'aide de Design and Analysis (version 2.4.3). Comme démontré dans cette étude, les quantités relatives ont été normalisées par rapport au gène ribosomal RpL19 (AGAP004422), dont l'expression n'a pas changé de manière significative avec l'alimentation sanguine 27 ou l'accouplement 3.
La qualité de l'ARN a été vérifiée à l'aide d'un bioanalyseur Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent). Les banques d'ADNc Illumina à extrémités appariées ont été préparées et analysées au Broad Institute du MIT et de Harvard. Les séquences de lecture ont été alignées sur le génome d'A. gambiae (souche PEST, version 4.12) à l'aide de HISAT2 (version 2.0.5) avec les paramètres par défaut. Les lectures présentant un score de qualité d'alignement (MAPQ) inférieur à 30 ont été éliminées à l'aide de Samtools (version 1.3.1). Le nombre de lectures alignées sur les gènes a été compté à l'aide de htseq-count (version 0.9.1) avec les paramètres par défaut. Les comptages de lectures normalisés ont été calculés et l'expression différentielle des gènes a été analysée à l'aide du package DESeq2 (version 1.28.1) dans R (version 4.0.3).
Les gènes candidats modifiant l'ecdysone ont été identifiés en interrogeant d'abord le génome d'A. gambiae à l'aide de l'algorithme PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), avec les paramètres par défaut et les séquences protéiques suivantes : EcK de Bombyx mori (numéro d'accès NP_001038956.1), Musca domestica (numéros d'accès XP_005182020.1, XP_005175332.1 et XP_011294434.1) et Microplitis demolitor (numéros d'accès XP_008552646.1 et XP_008552645.1), EcK de B. mori (numéro d'accès NP_001036900) et Drosophila melanogaster (numéro d'accès NP_651202). Apis mellifera (numéro d'accès XP_394838) et Acyrthosiphon pisum (numéro d'accès XP_001947166) ; et EPP de B. mori (numéros d'accès XP_001947166, NP_001177919.1 et NP_001243996.1) et EO de D. melanogaster (numéro d'accès NP_572986.1) (étape 1). Ensuite, filtrer les résultats en fonction d'une forte expression d'ARNm (>100 fragments/kilobase d'exons par million de lectures cartographiées (FPKM) ou >85 %) dans les tissus reproducteurs (LRT ou MAG femelles) en Gambie (étape 2). Afin d'améliorer la spécificité, nous avons sélectionné des enzymes candidates également exprimées dans le tissu reproducteur d'A. albimanus, une espèce d'anophèle qui ne synthétise ni ne transfère d'ecdysone lors de l'accouplement. Les gènes candidats ont été filtrés sur la base d'une faible expression (< 100 FPKM ou < 85e percentile) dans le tissu reproducteur d'A. albimanus (étape 3). Lors d'un filtrage final (étape 4), les gènes candidats devaient satisfaire à au moins un des critères suivants : (1) être significativement surexprimés après l'accouplement (P < 0,05) selon l'analyse des gènes différentiellement exprimés et (2) être présents dans les tissus non reproducteurs (< 85e percentile ou < 100 FPKM).
Nous avons modifié les méthodes décrites précédemment^28,29,30 pour réaliser le marquage isotopique de l'organisme entier. Brièvement, la levure sauvage Saccharomyces cerevisiae de type II (YSC2, Sigma) a été testée dans un milieu de culture contenant de l'azote (BD Difco, DF0335) et (p/v) 2 % de glucose (G7528, Sigma), 1,7 % de sulfate d'ammonium et 5 % de sulfate d'ammonium ¹⁵N (NLM-713, >99 %, Cambridge Isotope Laboratories) comme unique source d'azote. La levure a été récupérée par centrifugation et les larves de moustiques ont été nourries ad libitum jusqu'à la nymphose. Un supplément de farine de poisson (0,5 mg pour 300 larves) a été ajouté pour prévenir la mortalité au quatrième stade larvaire. Seules les femelles ont ensuite été utilisées dans des expériences d'accouplement avec des mâles non marqués afin d'analyser le protéome mâle transféré lors de l'accouplement.
Des femelles vierges marquées à l'azote 15 (¹⁵N) âgées de 4 à 6 jours ont été forcées de s'accoupler avec des mâles vierges non marqués du même âge. L'accouplement a été confirmé par la détection des bouchons copulatoires sous microscopie à épifluorescence. À 3, 12 et 24 heures post-accouplement (hpm), les oreillettes de 45 à 55 femelles accouplées ont été disséquées dans 50 µl de tampon bicarbonate d'ammonium (pH 7,8) et homogénéisées au pilon. L'homogénat a été centrifugé et le surnageant mélangé à 50 µl de RapiGest à 0,1 % (186001860, Waters) dans du bicarbonate d'ammonium 50 mM. Le surnageant et le culot de chaque échantillon ont été congelés instantanément sur glace carbonique et expédiés par transport express au laboratoire MacCoss de l'Université de Washington, où la préparation des échantillons pour l'analyse LC-MS/MS a été réalisée. Le culot a été remis en suspension dans 50 µl de RapiGest à 0,1 % dans du bicarbonate d'ammonium 50 mM. Après ajout de bicarbonate d'ammonium mM et sonication au bain-marie, la concentration protéique du culot et du surnageant a été mesurée par le test BCA. Les échantillons ont été réduits avec du dithiothréitol (DTT ; Sigma) 5 mM, alkylés avec de l'iodoacétamide (Sigma) 15 mM et incubés à 37 °C (ratio trypsine/substrat 1:50) pendant 1 heure. La lyse des cellules RapiGest a été réalisée par addition de HCl 200 mM, suivie d'une incubation à 37 °C pendant 45 minutes et d'une centrifugation à 14 000 tr/min pendant 10 minutes à 4 °C pour éliminer les débris. Les échantillons ont été lavés par extraction en phase solide bimodale (cartouches Oasis MCX, Waters) et remis en suspension dans de l'acide formique à 0,1 % pour une concentration protéique finale de 0,33 µg/µl. Les protéomes MAG non marqués ont été analysés de la même manière. à partir de mâles vierges. Deux réplicats analytiques ont été analysés pour chaque échantillon. Ensuite, 1 µg de chaque a été analysé à l'aide d'une colonne de silice fondue de 25 cm et de 75 µm avec un piège à fritte Kasil1 (PQ) de 4 cm en silice fondue rempli de résine à phase inverse Jupiter C12 (Phenomenex) et une chromatographie liquide de 180 minutes. Digestion des échantillons – L’analyse MS/MS a été réalisée sur un spectromètre de masse Q-Exactive HF (Thermo Fisher) couplé à un système nanoACQUITY UPLC (Waters). Les données d’acquisition générées pour chaque analyse ont été converties au format mzML à l’aide de Proteowizard (version 3.0.20287) et de Comet31 (version 3.2) en utilisant la base de données FASTA contenant les séquences protéiques d’Anopheles gambiae (VectorBase version 54), d’Anopheles coluzzi, de Mali-NIH (VectorBase version 54), de Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, mars 2021), du séquençage d’ARN d’A. gambiae et des traductions en trois cadres de lecture de contaminants humains connus. Les taux de faux positifs (FDR) correspondant à la carte peptidique ont été déterminés à l’aide de Percolator32 (version 3.05) avec un seuil de 0,01, et les peptides ont été assemblés pour identifier les protéines par parcimonie protéique dans Limelight33. (Version 2.2.0). L'abondance relative des protéines a été estimée à l'aide du facteur d'abondance spectrale normalisé (NSAF), calculé pour chaque protéine dans chaque analyse, comme décrit précédemment. Le NSAF relatif à chaque protéine a été moyenné sur les échantillons provenant de deux réplicats biologiques différents. Le marquage à l'azote 15 a masqué avec succès le protéome femelle, bien qu'une faible quantité de protéines non marquées ait pu être détectée chez les femelles vierges marquées. Nous avons observé une réduction de la quantité de protéines mâles (1 à 5 spectres) dans les échantillons bruts femelles uniquement lors des analyses techniques, où les échantillons bruts ont été analysés après les échantillons mâles/d'accouplement, en raison d'un « report » de la chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Les protéines occasionnellement identifiées comme « contaminants » chez les femelles vierges marquées sont listées dans le Tableau supplémentaire 1.
Deux peptides antigéniques, QTTDRVAPAPDQQQ (de l'isotype PA) et MESDGTTPSGDSEQ (des isotypes PA et PB), ont été utilisés dans Genscript. Ces deux peptides ont été combinés, puis conjugués à la protéine porteuse KLH et injectés à des lapins de Nouvelle-Zélande. Après la quatrième injection, les lapins ont été sacrifiés et les IgG totales ont été isolées par purification d'affinité. Les IgG du lapin présentant la plus grande spécificité pour l'EPP ont été utilisées pour des analyses de western blot.
Pour les western blots, les échantillons MAG (n = 10, où n représente le nombre d'échantillons de moustiques biologiquement indépendants) et LRT femelles (n = 30) provenant de mâles vierges âgés de 4 jours et de femelles vierges ou soumises à un accouplement forcé (< 10 jours après l'accouplement) ont été traités séparément. Un tampon d'extraction protéique (Tris 50 mM, pH 8,0 ; NP-40 1 % ; désoxycholate de sodium 0,25 % ; NaCl 150 mM ; EDTA 1 mM ; cocktail d'inhibiteurs de protéases 1× (Roche)) a été ajouté. Les échantillons ont été homogénéisés immédiatement après dissection à l'aide d'un broyeur à billes (billes de verre de 2 mm, 2 400 tr/min, 90 s). Les débris insolubles ont été éliminés par centrifugation à 20 000 g à 4 °C. Les protéines ont été quantifiées par le test de Bradford (Bio-Rad). Ensuite, 20 µg de protéines MAG, 40 µg de protéines LRT et… 20 µg de protéines résiduelles ont été dénaturées et séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de Bis-Tris (NuPAGE) à 10 % en tampon MOPS. Les protéines ont été transférées sur des membranes de polyfluorure de vinylidène (PVDF) à l'aide du système de transfert iBlot2 (Thermo Fisher). Les membranes ont été lavées deux fois dans du PBS-T 1× (0,1 % de Tween-20 dans du PBS) puis bloquées dans un tampon de blocage Odyssey (Li-Cor) pendant 1 heure à 22 °C. Les membranes ont été incubées sous agitation pendant une nuit à 4 °C avec un anticorps primaire polyclonal anti-EPP de lapin (dilution 1:700 dans le tampon de blocage) et un anticorps primaire monoclonal anti-actine de rat MAC237 (Abeam ; dilution 1:4000). Après lavage au PBS-T, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires (anti-lapin 800CW de dindon et anti-rat 680LT de chèvre (Li-Cor), tous deux à 1:20 000) dans le tampon de blocage. 0,01 % de SDS et 0,2 % de Tween-20 pendant 1 heure à 22 °C. Les membranes ont été lavées avec du PBS-T et imagées avec un scanner Odyssey CLx. Les images ont été collectées et traitées dans Image Studio (version 5.2). Aucune bande spécifique correspondant à l'isoforme EPP-RA (82 kDa) n'a été détectée.
Les régions codantes d'EPP (comme l'isoforme AGAP002463-RB contenant le domaine histidine phosphatase, recherche de domaine conservé NCBI 34) et d'EcK2 (AGAP002181) ont été clonées dans le plasmide pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma) ; Les amorces sont listées dans le Tableau 2 des données complémentaires. Huit linkers GS4 (en tandem) ont été insérés avant l'étiquette 6xHis C-terminale du vecteur pET-21a(+)-EcK2. Les protéines recombinantes ont été produites par synthèse protéique acellulaire d'E. coli à l'aide du kit NEBExpress (New England BioLabs). Les protéines recombinantes ont été purifiées sur colonnes de centrifugation Ni NEBExpress (New England BioLabs). La protéine de contrôle dihydrofolate réductase (DHFR) a été produite à partir de l'ADN matrice du kit de synthèse protéique acellulaire d'E. coli NEBExpress. Les protéines ont été conservées dans du glycérol à 50 % dans du PBS à -20 °C pendant une durée maximale de 3 mois.
L'activité phosphatase de l'EPP et des extraits tissulaires a été mesurée à l'aide de 4-nitrophénylphosphate (pNPP ; Sigma-Aldrich). Le tampon de réaction contenait 25 mM de Tris, 50 mM d'acide acétique, 25 mM de Bis-Tris, 150 mM de NaCl, 0,1 mM d'EDTA et 1 mM de DTT. Le tissu a été homogénéisé dans le tampon de réaction et les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation. La réaction a été initiée par l'ajout d'enzyme ou d'extrait tissulaire au tampon de réaction contenant 2,5 mg/ml de pNPP. Le mélange réactionnel a été incubé à température ambiante à l'obscurité, et la quantité de pNP convertie à partir du pNPP a été quantifiée par mesure de l'absorbance à 405 nm à différents temps.
Pour l'activité EcK in vitro, la protéine a été incubée avec 0,2 mg de 20E ou de 3D20E dans 200 µl de tampon (pH 7,5) contenant 10 mM d'HEPES-NaOH, 0,1 % de BSA, 2 mM d'ATP et 10 mM de MgCl₂ pendant 2 h à 27 °C. La réaction a été arrêtée par l'ajout de 800 µl de méthanol, puis le mélange a été refroidi à -20 °C pendant 1 heure, puis centrifugé à 20 000 g pendant 10 minutes à 4 °C. Le surnageant a ensuite été analysé par HPLC-MS/MS. Pour inactiver thermiquement les protéines utilisées dans le groupe témoin, celles-ci ont été incubées dans du glycérol à 50 % dans du PBS pendant 20 min à 95 °C.
Pour l'activité EPP in vitro, la protéine a été incubée avec 3D20E22P (quantité équivalente à celle présente dans 18 paires de MAG, purifiée par HPLC-MS/MS) dans 100 µl de tampon (pH 7,5) contenant 25 mM de Tris, 50 mM d'acide acétique, 25 mM de Bis-Tris, 150 mM de NaCl, 0,1 mM d'EDTA et 1 mM de DTT pendant 3 heures à 27 °C. La réaction a été arrêtée par l'ajout de 400 µl de méthanol et le mélange a été refroidi à -20 °C pendant 1 heure, puis centrifugé à 20 000 g pendant 10 minutes à 4 °C. Le surnageant a été analysé par HPLC-MS/MS.
Les fragments PCR pour EPP (362 pb), EcK1 (AGAP004574, 365 pb) et EcK2 (556 pb) ont été amplifiés à partir d'ADNc préparé à partir de cadavres de moustiques sans tête de sexe mixte. Le fragment PCR du contrôle eGFP (495 pb) a été amplifié à partir du pCR2.1-eGFP décrit précédemment ; Les amorces PCR sont listées dans le Tableau 2 des données complémentaires. Le fragment PCR a été inséré entre les promoteurs T7 inversés du plasmide pL4440. Les constructions plasmidiques ont été récupérées à partir de bactéries E. coli compétentes NEB 5-α (New England Biolabs) et vérifiées par séquençage d'ADN avant utilisation (voir les données supplémentaires 1 pour la séquence de l'insert). Des amorces complémentaires au promoteur T7 (Tableau 2 des données complémentaires) ont été utilisées pour amplifier l'insert à partir du plasmide dérivé de pL4440. La taille du produit PCR a été confirmée par électrophorèse sur gel d'agarose. L'ARNdb a été transcrit à partir des matrices PCR à l'aide du kit de transcription Megascript T7 (Thermo Fisher) et purifié selon les instructions du fabricant, avec les modifications décrites précédemment.
Pour l'injection d'ARNdb, 1 380 ng d'ARNdb (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) ont été injectés à une concentration de 10 ng/nl dans le thorax de mâles ou de femelles adultes (Nanoject III, Drummond) dans les 24 heures suivant l'éclosion. Les niveaux d'inhibition génique ont été déterminés dans au moins trois réplicats biologiques par extraction d'ARN, synthèse d'ADNc et RT-qPCR. Pour l'injection d'ecdysone, des femelles vierges de 4 jours ou des femelles vierges gorgées de sang âgées de 6 jours ont reçu une injection de 0,13, 0,21 ou 0,63 µg de 20E ou de 3D20E (Nanoject III, Drummond) à des concentrations respectives de 1,3 et 2,1 ng/nl, selon le protocole expérimental, ou de 6,3 ng/nl. Injecter 100 nl d'une solution à 10 % (vol/vol) éthanol dans l'eau ; 100 nl de 3D20E22P dans 10 % d'éthanol (équivalent à 75 % de la quantité trouvée dans une paire de MAG). Les moustiques ont été assignés au hasard au groupe d'injection.
Pour les tests de ponte, des femelles âgées de 3 jours ont été nourries ad libitum avec du sang humain. Les moustiques partiellement nourris ou non nourris ont été retirés. Selon le traitement, les femelles ont été placées dans des récipients de ponte séparés pendant quatre nuits, au moins 48 heures après le repas sanguin. Les œufs ont été comptés sous un stéréomicroscope (Stemi 508, Zeiss) ; chez les femelles fécondées, les œufs ayant éclos en larves ont été considérés comme fertiles.
Pour les essais d'accouplement, les femelles disposaient d'au moins deux jours, selon le traitement, pour développer une résistance à l'accouplement. Des mâles sauvages du même âge étaient ensuite introduits dans la même cage. Deux nuits plus tard, les vésicules fécondées des femelles étaient disséquées et l'ADN génomique était extrait par congélation-décongélation et sonication dans un tampon contenant 10 mM de Tris-HCl, 1 mM d'EDTA et 25 mM de NaCl (pH 8,2). Les échantillons étaient incubés avec de la protéinase K (0,86 µg/µl) pendant 15 minutes à 55 °C, puis pendant 10 minutes à 95 °C. Les préparations d'ADN génomique brut étaient diluées 10 fois et soumises à une qPCR pour la détection des séquences du chromosome Y ; les amorces sont listées dans le tableau 2 des données complémentaires. L'absence de séquence du chromosome Y indique l'absence d'accouplement.
Pour les tests de réaccouplement, les femelles soumises à un accouplement forcé ont été examinées afin de vérifier la présence de bouchons copulatoires et de confirmer leur statut d'accouplement. Elles ont ensuite été laissées pendant deux jours afin de développer une réfractarité à l'accouplement en l'absence de mâles, comme décrit précédemment³⁶. Des mâles porteurs de spermatozoïdes transgéniques DsRed ont alors été introduits dans les cages des femelles. Deux nuits plus tard, les vésicules fécondantes ont été prélevées chez les femelles, et l'ADN génomique a été préparé comme décrit précédemment et soumis à une qPCR pour la détection du transgène DsRed ; les amorces sont listées dans le Tableau 2 des données complémentaires. L'absence du transgène DsRed indiquait qu'aucun réaccouplement n'avait eu lieu.
Le composé 3D20E a été synthétisé selon le protocole décrit précédemment³⁷. Brièvement, 10 mg de 20E (Sigma-Aldrich) ont été dissous dans 10 ml d'eau, puis 30 mg de noir de platine (en poudre, Sigma-Aldrich) ont été ajoutés. Un léger courant d'O₂ a été continuellement insufflé dans le milieu réactionnel, qui a été agité à température ambiante. Après 6 heures, 30 ml de méthanol ont été ajoutés pour stopper la réaction. Le mélange a été centrifugé afin d'éliminer les particules de catalyseur. Le surnageant a été évaporé à sec sous vide à température ambiante. Le produit de réaction séché a été dissous dans un mélange d'éthanol à 10 % et de méthanol pour injection en vue de l'analyse par HPLC-MS/MS. Le taux de conversion (de 20E à 3D20E) était d'environ 97 % (Fig. 4b), et le spectre de masse du 3D20E synthétisé correspondait à celui observé chez les femelles fécondées (Fig. 4c).
La légende détaille les tests statistiques effectués. GraphPad (version 9.0) a été utilisé pour réaliser les tests exacts de Fisher, de Mantel-Cox et de Student. Les tests de Cochran-Mantel-Haenszel ont été réalisés à l'aide d'un script R personnalisé (disponible à l'adresse https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). La normalité de la distribution des données a été vérifiée par le test de Shapiro-Wilk, avec un seuil de signification de 0,05. En cas de non-normalité, le test de Mann-Whitney a été appliqué. Les données de survie ont été analysées par le test de Mantel-Cox. Le package DESeq2 (version 1.28.1) a été utilisé pour l'analyse d'expression différentielle des gènes à partir des données RNA-seq. La barre horizontale du graphique représente la médiane. Un seuil de signification de p = 0,05 a été retenu pour tous les tests.
Pour plus d'informations sur la méthodologie de l'étude, veuillez consulter le résumé du rapport de recherche de Nature associé à cet article.
Les données protéomiques MS ont été déposées dans le consortium ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) via le PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) avec l'identifiant de jeu de données PXD032157.
L'ensemble de données RNA-seq est déposé dans la Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) sous l'enregistrement sériel GSE198665.
Des jeux de données supplémentaires générés et/ou analysés au cours de cette étude peuvent être obtenus auprès des auteurs correspondants sur demande raisonnable. Cet article fournit les données sources.
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