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Les granules Ban-Lan-Gen atténuent la colite chronique récidivante induite par le sulfate de dextran sodique chez la souris en modulant le microbiote intestinal et en restaurant la production intestinale de GLP-1 dérivé des AGCC.
Jiao Peng,1-3,*Li Xi,4,*Zheng Lin,3,5 Duan Lifang,1 Gao Zhengxian,2,5 Diehu,1 Li Jie,6 Li Xiaofeng,6 Shen Xiangchun,5 Xiao Haitao21Département de pharmacie, Hôpital universitaire de Pékin à Shenzhen, Shenzhen, République populaire de Chine ; 2École de pharmacie, Centre des sciences de la santé de l’Université de Shenzhen, Shenzhen, République populaire de Chine ; 3Centre de recherche en ingénierie et technologie de la médecine ethnique et du développement et de l’application de la médecine traditionnelle chinoise, Université médicale de Guizhou, Ministère de l’Éducation, Laboratoire clé provincial de pharmacie de Guizhou, Université médicale de Guizhou, Guiyang, République populaire de Chine ; 4Département de gastro-entérologie, Hôpital universitaire de Pékin à Shenzhen, Shenzhen, République populaire de Chine ; 5École de pharmacie, Université médicale de Guizhou, Laboratoire clé d’État sur la fonction et l’application des plantes médicinales, Guiyang ; 6 Département de médecine de laboratoire, Hôpital universitaire de Pékin à Shenzhen, Shenzhen, Chine [email protected] Shen Xiangchun, Faculté de pharmacie, Université de médecine de Guizhou, Guizhou, République populaire de Chine, 550004, Courriel [email protected] Objectif : La thérapie à base de GLP-1 représente une nouvelle option thérapeutique pour les maladies inflammatoires de l’intestin. Les granules de Ban-Lan-Gen (BLG) sont une formulation antivirale connue de la médecine traditionnelle chinoise (MTC) qui présente une activité anti-inflammatoire potentielle dans le traitement de diverses affections inflammatoires. Cependant, son effet anti-inflammatoire sur la colite et son mécanisme d’action restent encore mal compris. MÉTHODES : Établir une colite chronique récidivante induite par le sulfate de dextran sodique (DSS) chez la souris. Les indices d’activité de la maladie, les marqueurs histologiques de lésions et les taux de cytokines pro-inflammatoires ont été mesurés afin d’évaluer l’effet protecteur du BLG. Les effets du BLG sur le microbiote intestinal et l’intestin ont été caractérisés par les taux sériques de GLP-1 et l’expression colique de Gcg, GPR41 et GRP43. Composition, taux d'AGCC fécaux et libération de GLP-1 par les cellules épithéliales coliques primaires de souris. Production de GLP-1 dérivé des AGCC. Résultats : Le traitement par BLG a significativement réduit la perte de poids, l'indice d'activité de la maladie (DAI), le raccourcissement du côlon, les lésions tissulaires coliques et les taux de cytokines pro-inflammatoires TNF-α, IL-1β et IL-6 dans le tissu colique. De plus, le traitement par BLG a significativement restauré l'expression colique de Gcg, GPR41 et GRP43 ainsi que les taux sériques de GLP-1 chez les souris atteintes de colite, en augmentant la prolifération de bactéries productrices d'AGCC telles qu'Akkermansia et Prevotellaceae_UCG-001, et en réduisant celle de bactéries telles qu'Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas et Oscillibacter. Enfin, le traitement par BLG a significativement augmenté le taux d'AGCC dans les selles des souris atteintes de colite. Parallèlement, des expériences in vitro ont également montré que l'extrait fécal de souris traitées par BLG stimule fortement la sécrétion de GLP-1 par les petites cellules épithéliales coliques murines primaires. Conclusions : Ces résultats suggèrent que le BLG possède un effet anti-colite. Le BLG pourrait être développé comme traitement, notamment en modulant le microbiote intestinal et en restaurant la production de GLP-1 dérivé des acides gras à chaîne courte intestinaux. Médicament prometteur pour la colite chronique récidivante. Mots-clés : colite, granules de Ban-Lan-Gen, microbiote intestinal, acides gras à chaîne courte, GLP-1
La rectocolite hémorragique (RCH) est une maladie inflammatoire chronique du côlon et du rectum caractérisée par des diarrhées récurrentes, des douleurs abdominales, une perte de poids et des selles mucopurulentes et sanglantes.¹ Récemment, la prévalence de la RCH a augmenté dans des pays où son incidence était auparavant faible, notamment en Chine, parallèlement à la popularisation des modes de vie occidentaux.² Cette augmentation représente un problème majeur de santé publique et a de graves conséquences sur la capacité de travail et la qualité de vie des patients. Notamment, la pathogenèse de la RCH reste largement méconnue, mais il est généralement admis que la génétique, les facteurs environnementaux, le microbiote intestinal et le système immunitaire contribuent à son développement.³ À ce jour, il n'existe aucun traitement curatif pour la RCH, et l'objectif du traitement est de contrôler les symptômes, d'induire et de maintenir la rémission, de favoriser la cicatrisation de la muqueuse et de réduire les récidives. Les traitements classiques comprennent les aminosalicylates, les corticostéroïdes, les immunosuppresseurs et les biothérapies. Cependant, ces médicaments n'atteignent pas toujours l'effet escompté en raison de leurs nombreux effets secondaires.⁴ Récemment, de nombreuses études de cas ont montré que les traitements traditionnels La médecine traditionnelle chinoise (MTC) a démontré un grand potentiel pour soulager la RCH avec une faible toxicité, ce qui suggère que le développement de nouvelles thérapies de MTC constitue une stratégie de traitement prometteuse pour la RCH.5-7
Les granulés de Banlangen (BLG) sont une préparation de médecine traditionnelle chinoise à base d'extrait aqueux de racine de Banlangen.⁸ Outre leur efficacité antivirale, les BLG présentent une activité anti-inflammatoire potentielle dans le traitement de diverses affections inflammatoires.⁹,¹⁰ De plus, des glucosinolates (R,S-goitrine, progoitrine, épiprorubine et glucoside ont été isolés et identifiés dans les extraits aqueux de Radix isatidis), des nucléosides (hypoxanthine, adénosine, uridine et guanosine) et des alcaloïdes indigiques tels que l'indigo et l'indirubine.¹¹,¹² Des études antérieures ont bien démontré que l'adénosine, l'uridine et l'indirubine exercent de puissants effets anti-colites dans différents modèles animaux de colite.¹³⁻¹⁷ Cependant, aucune étude fondée sur des preuves n'a été menée pour évaluer l'efficacité des BLG dans la colite. Dans la présente étude, nous avons examiné l'effet protecteur des BLG sur la colite chronique récidivante induite par le sulfate de dextran sodique (DSS). colite chez les souris C57BL/6 et ont constaté que l'administration orale de BLG atténuait significativement la colite chronique récidivante induite par le DSS chez les souris. L'inflammation, ses mécanismes de régulation sont associés à la modulation du microbiote intestinal et à la restauration de la production de peptide-1 de type glucagon (GLP-1) dérivé de l'intestin.
Les granules de BLG (sans sucre, approuvés par la NMPA sous le numéro Z11020357 ; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Pékin, Chine ; numéro de lot : 20110966) ont été achetés en pharmacie. Le DSS (masse moléculaire : 36 000–50 000 daltons) a été acheté auprès de MP Biologicals (Santa Ana, États-Unis). La sulfasalazine (SASP) (pureté ≥ 98 %), l’hématoxyline et l’éosine ont été achetées auprès de Sigma-Aldrich (Saint-Louis, Missouri, États-Unis). Les kits de dosage ELISA Luminex pour le TNF-α, l’IL-1β et l’IL-6 de souris ont été achetés auprès de R&D Systems (Minneapolis, Minnesota, États-Unis). L’acide acétique, l’acide propionique et l’acide butyrique ont été achetés auprès d’Aladdin Industries (Shanghai, Chine). L’acide 2-éthylbutyrique a été acheté auprès de Merck KGaA (Darmstadt, Allemagne).
Des souris mâles C57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines (poids corporel de 18 à 22 g) ont été achetées auprès de Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Pékin, Chine) et maintenues dans un environnement à 22 ± 2 °C avec un cycle lumière/obscurité de 12 h. Les souris ont été nourries avec un régime alimentaire standard pour rongeurs et ont eu libre accès à l'eau pendant une semaine afin de s'acclimater à leur nouvel environnement. Elles ont ensuite été réparties aléatoirement en quatre groupes : un groupe témoin, un groupe modèle DSS, un groupe traité par SASP (200 mg/kg, par voie orale) et un groupe traité par BLG (1 g/kg, par voie orale). Comme illustré sur la figure 1A, conformément à notre étude précédente, une colite chronique récidivante expérimentale a été induite chez les souris par trois cycles de DSS à 1,8 % pendant 5 jours, suivis d'eau distillée pendant 7 jours. Les souris des groupes SASP et BLG ont reçu un traitement quotidien par SASP et BLG, respectivement, à partir du jour 0. Lors des expériences préliminaires, la dose de BLG a été fixée à 1 g/kg. Parallèlement, la dose de SASP a été fixée à 200 mg/kg conformément à la littérature.4 Les groupes témoins et les groupes modèles DSS ont reçu le même volume d'eau tout au long de l'expérience.
Figure 1. Le BLG améliore la colite chronique récidivante induite par le DSS chez la souris. (A) Protocole expérimental de la colite chronique récidivante et traitement, (B) variation du poids corporel, (C) score de l'indice d'activité de la maladie (DAI), (D) longueur du côlon, (E) image représentative du côlon, (F) coloration H&E du côlon (grossissement ×100) et (G) score histologique. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard à la moyenne (n = 6). ##p < 0,01 ou ###p < 0,001 vs groupe contrôle (Con) ; *p < 0,05 ou **p < 0,01 ou ***p < 0,001 vs groupe DSS.
Le poids corporel, la consistance des selles et les saignements rectaux ont été enregistrés quotidiennement. L'indice d'activité de la maladie (DAI) a été déterminé en combinant les scores du poids corporel, de la consistance des selles et des saignements rectaux, comme décrit précédemment.19 À la fin de l'expérience, toutes les souris ont été euthanasiées et du sang, des selles et du côlon ont été prélevés pour des expériences ultérieures.
Le tissu colique a été fixé au formol et inclus en paraffine. Des coupes de 5 microns ont été réalisées et colorées à l'hématoxyline-éosine (H&E), puis analysées en aveugle et notées comme décrit précédemment.19
L’ARN total du tissu colique a été extrait à l’aide du réactif Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), puis l’ADNc a été obtenu par extraction à l’aide de la transcriptase inverse (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Japon). La PCR quantitative a été réalisée sur un système de PCR en temps réel avec le colorant SYBR Green Master (Roche, Bâle, Suisse). L’expression des transcrits des gènes cibles a été normalisée par rapport à la β-actine et les données ont été analysées par la méthode 2^-ΔΔCT. Les séquences des amorces sont présentées dans le tableau 1.
L’isolement et la culture de cellules épithéliales coliques primaires de souris ont été réalisés selon le protocole décrit précédemment.²⁰ Brièvement, les côlons de souris âgées de 6 à 8 semaines ont été prélevés après sacrifice par dislocation cervicale, puis ouverts longitudinalement, traités avec une solution saline équilibrée de Hanks (HBSS, sans calcium ni magnésium) et découpés en fragments de 0,5 à 1 mm. Les tissus ont ensuite été digérés avec 0,4 mg/mL de collagénase XI (Sigma, Poole, Royaume-Uni) dans du milieu DMEM sans calcium ni magnésium, puis centrifugés à 300 × g pendant 5 min à température ambiante. Le culot a été remis en suspension dans du milieu DMEM (supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal, 100 UI/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine) à 37 °C et filtré à travers un tamis de nylon (porosité d’environ 250 µm). Des aliquotes de cellules épithéliales coliques ont été déposées dans des boîtes de Petri à fond de verre et incubées. avec de l'acide acétique, de l'acide propionique, de l'acide butyrique et des extraits fécaux de souris pendant 2 heures à 37°C, 5% CO2.
Le tissu colique a été homogénéisé dans du PBS, et les concentrations des cytokines IL-6, TNF-α et IL-1β dans ce tissu ont été mesurées à l'aide de kits ELISA Luminex (R&D Systems, Minneapolis, MN, États-Unis). De même, les concentrations de GLP-1 dans le sérum et le milieu de culture des cellules épithéliales coliques murines primaires ont été déterminées à l'aide d'un kit ELISA (Bioswamp, Wuhan, Chine) selon les instructions du fabricant.
L'ADN total des selles a été extrait à l'aide d'un kit d'extraction d'ADN (Tiangen, Chine). La qualité et la quantité d'ADN ont été mesurées aux rapports d'absorbance 260 nm/280 nm et 260 nm/230 nm, respectivement. Ensuite, en utilisant chaque extrait d'ADN comme matrice, les amorces spécifiques 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) et 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) ont été utilisées pour amplifier les régions V3-V4 du gène de l'ARNr 16S dans différentes régions. Les produits de PCR ont été purifiés à l'aide du kit d'extraction sur gel QIAquick (QIAGEN, Allemagne), quantifiés par PCR en temps réel et séquencés à l'aide de la plateforme de séquençage Illumina MISEq PE300 (Illumina Inc., CA, États-Unis). Pour l'analyse bioinformatique, le traitement des données a été effectué selon les protocoles précédemment décrits.^21,22 Brièvement, Cutadapt (V1.9.1) a été utilisé pour filtrer les fichiers d'expression bruts. Les OTU ont été regroupées à l'aide d'UPARSE. (version 7.0.1001) avec un seuil de similarité de 97 %, et UCHIME a été utilisé pour supprimer les séquences chimériques. L'analyse et la classification de la composition de la communauté ont été réalisées à l'aide du classificateur RDP (http://rdp.cme.msu.edu/) basé sur la base de données de gènes d'ARN ribosomique SILVA.
Les niveaux d'acides gras à chaîne courte (acide acétique, acide propionique et acide butyrique) ont été mesurés comme décrit précédemment par Tao et al., avec quelques modifications.23 Brièvement, 100 mg de matières fécales ont d'abord été mis en suspension dans 0,4 mL d'eau déminéralisée, suivis de 0,1 mL d'acide sulfurique à 50 % et de 0,5 mL d'acide 2-éthylbutyrique (étalon interne), puis homogénéisés et chauffés à 4 °C. Centrifuger à 12 000 tr/min pendant 15 minutes à C. Le surnageant a été extrait avec 0,5 mL d'éther et injecté dans le GC pour analyse. Pour l'analyse par chromatographie en phase gazeuse (CPG), les échantillons ont été analysés à l'aide d'un chromatographe en phase gazeuse GC-2010 Plus (Shimadzu, Inc.) équipé d'un détecteur à ionisation de flamme (FID). La séparation a été réalisée à l'aide d'une colonne ZKAT-624, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., Chine). Les données ont été acquises à l'aide du logiciel GC Solution (Shimadzu, Inc.). Le rapport de division était de 10:1, le gaz vecteur était l'azote et le débit était de 6 mL/min. Le volume d'injection était de 1 μL. La température de l'injecteur et du détecteur était de 300 °C. La température du four a été maintenue à 140 °C pendant 13,5 minutes, puis augmentée à 250 °C à une vitesse de 120 °C/min ; la température a été maintenue pendant 5 minutes.
Les données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). La significativité des données a été évaluée par une analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie du test de Duncan. Le logiciel GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, États-Unis) a été utilisé pour tous les calculs et une valeur de p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
Il est bien connu que la RCH est une colite chronique récidivante caractérisée par de fortes douleurs abdominales, des diarrhées et des saignements. Par conséquent, un modèle de colite chronique récidivante induite par le DSS a été établi chez la souris afin d'évaluer l'efficacité anti-colite du BLG (Fig. 1A). Comparées au groupe témoin, les souris du groupe DSS présentaient un poids corporel significativement réduit et un DAI plus élevé, et ces modifications ont été significativement inversées après 24 jours de traitement par BLG (Fig. 1B et C). Le raccourcissement du côlon est une caractéristique importante de la RCH. Comme le montrent les figures 1D et E, la longueur du côlon des souris ayant reçu du DSS était significativement réduite, mais ce raccourcissement a été atténué par le traitement au BLG. Par la suite, une analyse histopathologique a été réalisée pour évaluer l'inflammation colique. Les images colorées à l'hématoxyline-éosine (H&E) et les scores pathologiques ont montré que l'administration de DSS perturbait significativement l'architecture colique et entraînait une destruction des cryptes, tandis que le traitement par BLG réduisait significativement la destruction des cryptes et les scores pathologiques (Fig. 1F et G). Notamment, l'effet protecteur du BLG à une dose de 1 La valeur g/Kg était comparable à celle du SASP à une dose de 200 mg/Kg. Collectivement, ces résultats suggèrent que le BLG est efficace pour réduire la gravité de la colite chronique récurrente induite par le DSS chez la souris.
Le TNF-α, l'IL-1β et l'IL-6 sont d'importants marqueurs de l'inflammation colique. Comme illustré sur la figure 2A, le DSS induit une augmentation significative de l'expression génique du TNF-α, de l'IL-1β et de l'IL-6 dans le côlon, comparativement au groupe témoin. L'administration de BLG permet d'inverser significativement ces modifications induites par le DSS. Nous avons ensuite utilisé la technique ELISA pour déterminer les concentrations des cytokines inflammatoires TNF-α, IL-1β et IL-6 dans le tissu colique. Les résultats ont également montré que les concentrations coliques de TNF-α, IL-1β et IL-6 étaient significativement augmentées chez les souris traitées au DSS, tandis que le traitement par BLG atténuait ces augmentations (figure 2B).
Figure 2. La BLG inhibe l'expression génique et la production des cytokines pro-inflammatoires TNF-α, IL-1β et IL-6 dans le côlon de souris traitées au DSS. (A) Expression génique colique de TNF-α, IL-1β et IL-6 ; (B) taux de protéines coliques de TNF-α, IL-1β et IL-6. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard à la moyenne (n = 4–6). #p < 0,05 ou ##p < 0,01 ou ###p < 0,001 vs groupe contrôle (Con) ; *p < 0,05 ou **p < 0,01 vs groupe DSS.
La dysbiose intestinale joue un rôle crucial dans la pathogenèse de la RCH.²⁴ Afin d'étudier si la BLG module le microbiote intestinal de souris traitées au DSS, un séquençage de l'ARNr 16S a été réalisé pour analyser la communauté bactérienne du contenu intestinal. Le diagramme de Venn montre que les trois groupes partagent 385 OTU. Parallèlement, chaque groupe présente des OTU uniques (Fig. 3A). De plus, les indices de Chao1 et de Shannon (Fig. 3B et C) indiquent une réduction de la diversité du microbiote intestinal chez les souris traitées à la BLG, l'indice de Shannon étant significativement diminué dans ce groupe. L'analyse en composantes principales (ACP) et l'analyse en coordonnées principales (PCoA) ont permis de déterminer les regroupements entre les trois groupes et ont montré que la structure du microbiote des souris traitées au DSS était clairement distincte après traitement à la BLG (Fig. 3D et E). Ces résultats suggèrent que le traitement à la BLG influence significativement la structure du microbiote des souris atteintes de colite induite par le DSS.
Figure 3. Le BLG modifie la diversité du microbiote intestinal chez les souris atteintes de colite induite par le DSS. (A) Diagramme de Venn des OTU, (B) Indice Chao1, (C) Indice de richesse de Shannon, (D) Analyse en composantes principales (ACP) des OTU, (E) Analyse en coordonnées principales (ACP) des OTU. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard à la moyenne (n = 6). **p < 0,01 vs groupe DSS.
Pour évaluer les modifications spécifiques du microbiote fécal, nous avons analysé sa composition à tous les niveaux taxonomiques. Comme illustré sur la figure 4A, les principaux phylums dans tous les groupes étaient les Firmicutes et les Bacteroidetes, suivis des Verrucomicrobia. L'abondance relative des Firmicutes et le rapport Firmicutes/Bacteroidetes étaient significativement augmentés dans les communautés microbiennes fécales des souris traitées au DSS par rapport aux souris témoins, et ces modifications étaient significativement inversées après traitement au BLG. En particulier, le traitement au BLG augmentait significativement l'abondance relative de Verrucobacterium dans les selles des souris atteintes de colite induite par le DSS. Au niveau du microbiote fécal, les communautés microbiennes fécales étaient composées de Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae et Prevotellaceae (Fig. 4B). Comparé au groupe DSS, l'absence de BLG augmentait l'abondance des Akkermansiaceae, mais diminuait celle des Lachnospiriaceae. Ruminococcaceae. Notamment, au niveau du genre, le microbiote fécal était composé de Lachnospira_NK4A136_group, Akkermansia et Prevotellaceae_UCG-001 (Fig. 4C). Ce résultat a également démontré que le traitement par BLG a efficacement inversé le déséquilibre du microbiote en réponse à l'exposition au DSS, caractérisé par une diminution d'Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas et Oscillibacter, et une augmentation d'Akkermansia et de Prevotellaceae_UCG-001.
Figure 4. Le BLG modifie l'abondance du microbiote intestinal chez des souris atteintes de colite induite par le DSS. (A) Abondance du microbiote intestinal au niveau du phylum ; (B) Abondance du microbiote intestinal au niveau de la famille ; (C) Abondance du microbiote intestinal au niveau du genre. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard à la moyenne (n = 6). #p < 0,05 ou ###p < 0,001 vs groupe contrôle (Con) ; *p < 0,05 ou **p < 0,01 ou ***p < 0,001 vs groupe DSS.
Étant donné que les acides gras à chaîne courte (AGCC) sont les principaux métabolites d'Akkermansia et de Prevotellaceae_UCG-001, et que l'acétate, le propionate et le butyrate sont les AGCC les plus abondants dans la lumière intestinale, 25-27 nous poursuivons notre étude. Comme le montre la figure 5, les concentrations fécales d'acétate, de propionate et de butyrate ont été significativement réduites dans le groupe traité au DSS, tandis que le traitement au BLG a largement atténué cette réduction.
Figure 5. La BLG augmente les taux d'AGCC dans les fèces de souris atteintes de colite induite par le DSS. (A) Teneur en acide acétique dans les fèces ; (B) teneur en acide propionique dans les fèces ; (C) teneur en acide butyrique dans les fèces. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard à la moyenne (n = 6). #p < 0,05 ou ##p < 0,01 vs groupe témoin (Con) ; *p < 0,05 ou **p < 0,01 vs groupe DSS.
Nous avons ensuite calculé le coefficient de corrélation de Pearson entre les concentrations différentielles d'acides gras à chaîne courte (AGCC) au niveau du genre et le microbiote fécal. Comme illustré sur la figure 6, Akkermansia était positivement corrélé à la production d'acide propionique (Pearson = 0,4866) et d'acide butyrique (Pearson = 0,6192). En revanche, Enteromonas et Oscillobacter étaient tous deux négativement associés à la production d'acétate, avec des coefficients de Pearson respectifs de 0,4709 et 0,5104. De même, Ruminococcaceae_UCG-014 était négativement corrélé à la production d'acide propionique (Pearson = 0,4508) et d'acide butyrique (Pearson = 0,5842).
Figure 6 Analyse de corrélation de Pearson entre les différents SCFA et les microbes coliques. (A) Enteromonas avec acide acétique ; (B) Bacillus concussion avec acide acétique ; (C) Akkermansia vs acide propionique ; (D) Ruminococcus_UCG-014 avec acide propionique ; (E) Akkermansia avec acide butyrique ; (F) Ruminococcus_UCG-014 avec acide butyrique.
Le peptide-1 de type glucagon (GLP-1) est un produit de transformation post-traductionnelle spécifique du proglucagon (Gcg) et possédant des propriétés anti-inflammatoires.²⁸ Comme illustré sur la figure 7, le DSS induit une diminution significative de l'expression de l'ARNm du Gcg. Le traitement du côlon par le BLG a permis d'inverser significativement la réduction du Gcg induite par le DSS, comparativement au groupe témoin (Fig. 7A). Parallèlement, le taux de GLP-1 sérique était significativement réduit dans le groupe traité par le DSS, et le traitement par le BLG a permis de prévenir en grande partie cette réduction (Fig. 7B). Les acides gras à chaîne courte pouvant stimuler la sécrétion de GLP-1 via l'activation des récepteurs couplés aux protéines G 43 (GRP43) et 41 (GRP41), nous avons également examiné l'expression de GRP41 et GRP43 dans le côlon de souris atteintes de colite. Nous avons constaté que l'expression de l'ARNm colique de GRP43 et GRP41 était significativement diminuée après l'administration de DSS, et que le traitement par le BLG pouvait l'inverser efficacement. pour compenser ces diminutions (figures 7C et D).
Figure 7. La BLG augmente les taux sériques de GLP-1 et l'expression des ARNm de Gcg, GPR41 et GRP43 dans le côlon chez les souris traitées au DSS. (A) Expression de l'ARNm de Gcg dans le tissu colique ; (B) Taux de GLP-1 sérique ; (C) Expression de l'ARNm de GPR41 dans le tissu colique ; (D) Expression de l'ARNm de GPR43 dans le tissu colique. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard à la moyenne (n = 5–6). #p < 0,05 ou ##p < 0,01 vs groupe contrôle (Con) ; *p < 0,05 vs groupe DSS.
Étant donné que le traitement par BLG pouvait augmenter les taux sériques de GLP-1, l'expression de l'ARNm de Gcg dans le côlon et les taux d'AGCC fécaux chez les souris traitées au DSS, nous avons examiné plus en détail l'effet de l'acétate, du propionate et du butyrate, ainsi que celui de différentes concentrations d'acide acétique, de propionate et de butyrate, sur la libération de GLP-1 par les cellules épithéliales coliques primaires de souris. Comme illustré sur la figure 8A, les cellules épithéliales coliques primaires de souris traitées respectivement avec 2 mM d'acide acétique, d'acide propionique et d'acide butyrique ont significativement stimulé la libération de GLP-1, conformément aux études précédentes.^29,30 De même, les concentrations de F-Con, F-DSS et F-BLG (équivalentes à 0,25 g de matières fécales) ont fortement stimulé la libération de GLP-1 par les cellules épithéliales coliques primaires de souris. Notamment, la quantité de GLP-1 libérée par les cellules épithéliales coliques primaires de souris traitées par F-DSS était significativement plus élevée. était beaucoup plus faible que celle des cellules épithéliales coliques primaires de souris traitées par F-Con et F-BLG (Figure 8B). Ces données suggèrent que le traitement par BLG a restauré de manière significative la production de GLP-1 dérivé des SCFA intestinaux.
Figure 8. Les acides gras à chaîne courte (AGCC) dérivés de la BLG stimulent la libération de GLP-1 par les cellules épithéliales coliques primaires de souris. (A) L'acide acétique, l'acide propionique et l'acide butyrique ont stimulé la libération de GLP-1 par les cellules épithéliales coliques primaires de souris ; (B) les extraits fécaux F-Con, F-DSS et F-BLG ont stimulé la libération de GLP-1 par les cellules épithéliales coliques primaires de souris. Quantité de GLP-1 libérée. Des aliquotes de cellules épithéliales coliques ont été placées dans des boîtes de Petri à fond de verre et traitées respectivement avec 2 mM d'acide acétique, d'acide propionique, d'acide butyrique et d'extraits fécaux F-Con, F-DSS et F-BLG (équivalent à 0,25 g de matières fécales). 2 heures à 37 °C, 5 % de CO2, respectivement. La quantité de GLP-1 libérée par les cellules épithéliales coliques murines primaires a été détectée par ELISA. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM (n = 3). #p < 0,05 ou ##p < 0,01 vs. blanc ou F-Con ; *p < 0,05 vs. F-DSS.
Abréviations : Ace, acide acétique ; Pro, acide propionique ; P, acide butyrique ; F-Con, extrait fécal de souris témoins ; F-DSS, extrait fécal de souris atteintes de colite ; F-BLG, extrait fécal de souris traitées au BLG. Extraits fécaux de souris inflammatoires.
Classée par l'Organisation mondiale de la santé comme une maladie réfractaire, la RCH devient un danger mondial ; Cependant, les méthodes efficaces de prédiction, de prévention et de traitement de la maladie restent limitées. Il est donc urgent d'explorer et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques sûres et efficaces pour la RCH. Les préparations de médecine traditionnelle chinoise constituent une option prometteuse, car nombre d'entre elles se sont révélées efficaces dans le traitement de la RCH au sein de la population chinoise au cours des siècles. De plus, elles sont toutes composées de substances organiques et naturelles, généralement inoffensives pour l'homme et l'animal.^31,32 Cette étude visait à identifier une préparation de médecine traditionnelle chinoise sûre et efficace pour le traitement de la RCH et à explorer son mécanisme d'action. La lactosérum bioactif (BLG) est une formule de phytothérapie chinoise bien connue, utilisée pour traiter la grippe.^8,33 Des travaux menés dans notre laboratoire et ailleurs ont montré que l'indigo, un produit de médecine traditionnelle chinoise transformé à partir de la même matière première que le BLG, présente une efficacité significative dans le traitement de la RCH chez l'homme et l'animal.^4,34 Toutefois, les effets anti-colites du BLG et leur mécanisme d'action restent mal compris. Dans la présente étude, nos résultats démontrent que le BLG atténue efficacement l'inflammation colique induite par le DSS, qui est associée à… Modulation du microbiote intestinal et restauration de la production de GLP-1 d'origine intestinale.
Il est bien connu que la RCH est caractérisée par des périodes de rechute présentant des signes cliniques typiques, tels qu'une perte de poids, des diarrhées, des saignements rectaux et d'importantes lésions de la muqueuse colique.³⁵ Ainsi, une colite chronique récidivante a été induite par l'administration de trois cycles de DSS à 1,8 % pendant cinq jours, suivis de sept jours d'hydratation. Comme illustré sur la figure 1B, les fluctuations de la perte de poids et du score DAI ont indiqué l'induction réussie d'une colite chronique récidivante. Les souris du groupe traité par BLG ont présenté une amélioration progressive à partir du 8^e jour, significativement différente de celle observée au 24^e jour. Les mêmes variations ont également été observées au niveau du score DAI, suggérant une amélioration clinique de la colite. Concernant les lésions coliques et l'état inflammatoire, la longueur du côlon, les lésions tissulaires coliques, ainsi que l'expression génique et la production des cytokines pro-inflammatoires TNF-α, IL-1β et IL-6 dans le tissu colique ont également été nettement améliorées après le traitement par BLG. L'ensemble de ces résultats démontre clairement l'efficacité du BLG dans le traitement de la colite chronique récidivante. souris.
Comment la BLG exerce-t-elle ses effets pharmacologiques ? De nombreuses études antérieures ont montré que le microbiote intestinal joue un rôle clé dans la pathogenèse de la RCH, et les thérapies basées sur le microbiome et ciblant celui-ci constituent une stratégie très prometteuse pour le traitement de cette maladie. Dans la présente étude, nous avons démontré que le traitement par BLG induit des modifications significatives de la composition du microbiote intestinal, suggérant que l’effet protecteur de la BLG contre la colite induite par le DSS est lié à la modulation de ce microbiote. Cette observation corrobore l’idée que la reprogrammation de l’homéostasie du microbiote intestinal représente une approche importante pour comprendre l’efficacité des préparations de médecine traditionnelle chinoise (MTC).^36,37 Il est à noter qu’Akkermansia est une bactérie Gram négative et strictement anaérobie vivant dans la couche de mucus de l’intestin, où elle dégrade les mucines, produit de l’acide propionique, stimule la différenciation des cellules caliciformes et maintient l’intégrité de la muqueuse. fonction d'intégrité de la barrière.26 De nombreuses données cliniques et animales suggèrent qu'Akkermansia est fortement associée à une muqueuse saine,38 et à l'administration orale d'Akkermansia spp. peut améliorer significativement l'inflammation de la muqueuse.³⁹ Nos données actuelles suggèrent que l'abondance relative d'Akkermansia augmente significativement après un traitement par BLG. De plus, Prevotellaceae_UCG-001 est une bactérie productrice d'AGCC.²⁷ Plusieurs études ont montré que Prevotellaceae_UCG-001 était présente en faible abondance relative dans les fèces d'animaux atteints de colite.^40,41 Nos données actuelles montrent également que le traitement par BLG peut augmenter significativement l'abondance relative de Prevotellaceae_UCG-001 dans le côlon de souris traitées par DSS. En revanche, Oscillibacter est une bactérie mésophile, strictement anaérobie.⁴² Il a été rapporté que l'abondance relative d'Oscillibacter était significativement augmentée chez les souris atteintes de RCH et était significativement corrélée positivement avec les taux d'IL-6 et d'IL-1β et les scores pathologiques.^43,44 Notamment, le traitement par BLG a réduit significativement l'abondance relative d'Oscillibacter dans les fèces de souris traitées par DSS. Notamment, ces modifications induites par le BLG Les bactéries étaient les plus productrices d'AGCC. De nombreuses études antérieures ont démontré les effets bénéfiques potentiels des AGCC sur l'inflammation colique et la protection de l'intégrité de l'épithélium intestinal.^45,46 Nos données actuelles ont également montré que les concentrations d'acétate, de propionate et de butyrate d'AGCC dans les fèces des souris traitées au DSS étaient fortement augmentées chez les souris traitées au BLG. Pris ensemble, ces résultats démontrent clairement que le traitement au BLG peut augmenter efficacement la production d'AGCC induite par le DSS chez les souris atteintes de colite chronique récidivante.
Le GLP-1 est une incrétine principalement produite dans l'iléon et le côlon, qui joue un rôle important dans le ralentissement de la vidange gastrique et la réduction de la glycémie postprandiale.⁴⁷ Des données suggèrent que la dipeptidyl peptidase (DPP)-4, un agoniste du récepteur du GLP-1, et une nanomédecine à base de GLP-1 peuvent atténuer efficacement l'inflammation intestinale chez la souris.^48-51 Comme rapporté dans des études précédentes, des concentrations élevées d'acides gras à chaîne courte (AGCC) étaient associées à des taux plasmatiques de GLP-1 élevés chez l'homme et la souris.⁵² Nos données actuelles montrent qu'après un traitement par BLG, les taux sériques de GLP-1 et l'expression de l'ARNm de Gcg étaient significativement augmentés. De même, la sécrétion de GLP-1 était significativement augmentée dans les cultures coliques après stimulation par des extraits fécaux de souris atteintes de colite traitées par BLG, comparativement à une stimulation par des extraits fécaux de souris atteintes de colite traitées par DSS. Comment les AGCC affectent-ils la libération de GLP-1 ? Gwen Tolhurst et al. Il a été rapporté que les acides gras à chaîne courte (AGCC) peuvent stimuler la sécrétion de GLP-1 via GRP43 et GPR41.²⁹ Nos données actuelles montrent également que le traitement par BLG augmente significativement l'expression de l'ARNm de GRP43 et GPR41 dans le côlon de souris traitées par DSS. Ces données suggèrent que le traitement par BLG peut restaurer la production de GLP-1 induite par les AGCC en activant GRP43 et GPR41.
BLG est un médicament en vente libre (OTC) à long terme en Chine. La dose maximale tolérée de BLG chez la souris Kunming est de 80 g/kg, et aucune toxicité aiguë n'a été observée.⁵³ Actuellement, la dose recommandée de BLG (sans sucre) chez l'humain est de 9 à 15 g/jour (3 fois par jour). Notre étude a montré qu'à la dose de 1 g/kg, la BLG améliorait la colite chronique récidivante induite par le DSS chez la souris. Cette dose est proche de celle utilisée en clinique. Notre étude a également révélé que son mécanisme d'action est médié, au moins en partie, par des modifications du microbiote intestinal, notamment par la production de bactéries à chaîne courte (AGCC), telles qu'Akkermansia et Prevotellaceae_UCG-001, afin de restaurer la production de GLP-1 d'origine intestinale. Ces résultats suggèrent que la BLG mérite d'être étudiée plus en détail comme agent thérapeutique potentiel pour le traitement clinique de la colite. Cependant, le mécanisme exact par lequel elle module le microbiote intestinal reste à confirmer par des études sur des souris déficientes en microbiote et par transplantation de bactéries fécales.
Ace, acide acétique ; but, acide butyrique ; BLG, pandan ; DSS, sulfate de dextran sodique ; DAI, indice d’activité de la maladie ; DPP, dipeptidyl peptidase ; FID, détecteur à ionisation de flamme ; F-Con, extraits fécaux témoins de souris ; F-DSS, extraits fécaux de souris atteintes de colite induite par le DSS ; F-BLG, extraits fécaux de souris atteintes de colite traitée par le BLG ; GLP-1, peptide-1 de type glucagon ; Gcg, glucagon ; chromatographie en phase gazeuse ; GRP43, récepteur 43 couplé aux protéines G ; GRP41, récepteur 41 couplé aux protéines G ; H&E, hématoxyline-éosine ; HBSS, solution saline équilibrée de Hanks ; OTC, OTC ; PCA, analyse en composantes principales ; PCoA, analyse en coordonnées principales ; Pro, acide propionique ; SASP, sulfasalazine ; SCFA, acides gras à chaîne courte ; médecine chinoise, médecine traditionnelle chinoise. RCH, colite ulcéreuse.
Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité d'éthique animale du Centre médical de l'Université de Pékin Shenzhen-Hong Kong University of Science and Technology (Shenzhen, Chine) conformément aux directives institutionnelles et à la réglementation animale (numéro d'éthique A2020157).
Tous les auteurs ont apporté une contribution significative à la conception et à la réalisation de l'étude, à l'acquisition des données, ou à leur analyse et interprétation ; ont participé à la rédaction de l'article ou à la révision critique de son contenu intellectuel important ; ont accepté de soumettre le manuscrit à la présente revue ; ont finalement approuvé la version pour publication ; sont responsables de tous les aspects du travail.
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81560676 et 81660479), le projet de première classe de l'Université de Shenzhen (86000000210), le Fonds du Comité d'innovation scientifique et technologique de Shenzhen (JCYJ20210324093810026), le Fonds provincial de recherche en sciences et technologies médicales du Guangdong (A2020157 et A2020272), le Laboratoire clé financé par la pharmacie de l'Université médicale de Guizhou (YWZJ2020-01) et l'Hôpital de l'Université de Pékin à Shenzhen (JCYJ2018009).
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2. Kaplan GG. La charge mondiale des MII : de 2015 à 2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2015 ; 12 : 720-727. doi : 10.1038/nrgastro.2015.150
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