Le tri des protéines dans la voie de sécrétion est essentiel au maintien de la compartimentation et de l'homéostasie cellulaires. Outre le tri médié par la membrane externe, le rôle des lipides dans le tri par la kinésine lors du transport sécrétoire constitue une question fondamentale de longue date restée sans réponse. Dans cette étude, nous avons réalisé une imagerie 3D simultanée multicolore à haute résolution et en temps réel afin de démontrer in vivo que les protéines nouvellement synthétisées, immobilisées par du glycosylphosphatidylinositol et présentant de très longues chaînes lipidiques de céramide, sont regroupées et classées dans des sites de sortie spécifiques de l'endoplasme, différents de ceux utilisés par les protéines transmembranaires. De plus, nous avons montré que la longueur de la chaîne de céramide dans la membrane du réticulum endoplasmique est cruciale pour cette sélectivité de tri. Notre étude apporte la première preuve directe in vivo de la classification des protéines transportées, en fonction de la longueur de leur chaîne lipidique, vers des sites d'exportation sélectifs dans la voie de sécrétion.
Chez les cellules eucaryotes, les protéines synthétisées dans le réticulum endoplasmique (RE) sont triées lors de leur transport par la voie de sécrétion pour être acheminées vers leur destination cellulaire appropriée (1). Outre le tri médié par le manteau membranaire, on a longtemps supposé que certains lipides pouvaient également servir de points de sortie sélectifs en les regroupant dans des domaines membranaires spécifiques associés à des protéines spécifiques (2-5). Cependant, il manque encore des preuves directes in vivo pour confirmer ce mécanisme potentiel basé sur les lipides. Afin de résoudre ce problème fondamental, nous avons étudié chez la levure comment les protéines ancrées au glycosylphosphatidylinositol (GPI-AP) sont exportées de manière différentielle du RE. Les GPI-AP sont diverses protéines de surface cellulaire liées à des lipides (6, 7). Une GPI-AP est une protéine sécrétée attachée au feuillet externe de la membrane plasmique par un groupement glycolipidique (ancre GPI). Elles acceptent les ancres GPI comme modifications post-traductionnelles conservatives dans la lumière du RE (8). Après fixation, le GPI-AP traverse l'appareil de Golgi (5, 9) depuis le réticulum endoplasmique (RE) jusqu'à la membrane plasmique. La présence d'ancres GPI permet un transport séparé du GPI-AP des protéines sécrétées transmembranaires (y compris d'autres protéines membranaires) le long de la voie de sécrétion (5, 9, 10). Chez la levure, les GPI-AP sont séparés des autres protéines sécrétées dans le RE, puis conditionnés dans des vésicules spécifiques enveloppées par le complexe protéique de revêtement II (COPII) (6, 7). Les déterminants de ce processus de classification lors de l'exportation depuis le RE restent obscurs, mais il est supposé que ce mécanisme pourrait nécessiter des lipides, notamment le remodelage structural de la partie lipidique de l'ancre GPI (5, 8). Chez la levure, ce remodelage lipidique débute immédiatement après la fixation du GPI et, dans de nombreux cas, induit la liaison du céramide à l'acide gras saturé à longue chaîne de 26 carbones (C26:0) (11, 12). Le céramide C26 est le principal céramide produit à ce jour par les cellules de levure. Synthétisé dans le réticulum endoplasmique (RE), il est majoritairement exporté vers l'appareil de Golgi via des vésicules COPII (13). L'exportation du GPI-AP hors du RE nécessite une synthèse continue de céramide (14, 15), et la conversion du céramide en inositol phosphate céramide (IPC) dans l'appareil de Golgi dépend de la synthèse de l'ancre GPI (16). Des études biophysiques réalisées sur des membranes artificielles ont montré que les céramides à très longue chaîne acyle peuvent s'assembler pour former des domaines ordonnés aux propriétés physiques uniques (17, 18). Ces données suggèrent que le céramide C26 et le GPI-AP associé au céramide C26 exploitent leurs propriétés physiques pour s'organiser en régions ordonnées au sein de l'environnement lipidique relativement désordonné de la membrane du RE. Celle-ci est principalement composée de glycérolipides courts et insaturés (C16:1 et C18:1) (19, 20). Ces régions seront sélectivement ciblées sur des sites de sortie ER spécifiques (ERES), où le céramide et le GPI-AP à base de céramide peuvent être co-transportés vers le Golgi dans la même vésicule COPII dédiée (5).
Dans cette étude, nous avons testé directement ce mécanisme à base de lipides en utilisant la microscopie d'imagerie confocale en temps réel à super-résolution (SCLIM), une technique de microscopie de pointe qui peut observer simultanément des protéines marquées par fluorescence. Les images en trois couleurs et tridimensionnelles (3D) ont une résolution et une vitesse extrêmement élevées dans les cellules vivantes (21, 22).
Nous avons d'abord appliqué la technologie SCLIM pour mieux comprendre comment les GPI-AP classiques portant un groupe céramide C26 sont éliminés des protéines transmembranaires sécrétées après leur sortie du réticulum endoplasmique (RE) chez *Saccharomyces cerevisiae*. Afin de vérifier la classification du RE, nous avons utilisé un système génétique permettant de visualiser directement les protéines nouvellement synthétisées entrant dans le système de sortie du RE (ERES) *in vivo* (7, 23). Nous avons choisi comme protéines cibles *Gas1*, un GPI-AP à base de céramide C26 marqué par la protéine fluorescente verte (GFP), et *Mid2*, une protéine transmembranaire sécrétée marquée par la protéine fluorescente proche infrarouge (iRFP), toutes deux ciblant la membrane plasmique (24–26). Chez le mutant thermosensible *sec31-1*, ces deux protéines sont exprimées sous le contrôle d'un promoteur inductible par le galactose et d'un marqueur ERES constitutif. À la température extrême de 37 °C, la mutation sec31-1, en affectant la fonction de la protéine Sec31, composant du manteau COPII, inhibe la germination de COPII et l'exportation hors du réticulum endoplasmique (RE). De ce fait, les protéines nouvellement synthétisées s'accumulent dans le RE (23). Après refroidissement à basse température (24 °C), les cellules mutantes sec31-1 récupèrent de leur zone sécrétoire et les protéines nouvellement synthétisées accumulées commencent à être exportées du RE. La visualisation par CLIM a montré que la majeure partie des protéines Gas1-GFP et Mid2-iRFP nouvellement synthétisées s'accumule encore dans le RE des cellules mutantes sec31-1 après une incubation à 37 °C, puis est libérée à 24 °C pendant 5 minutes (Figure 1). Étant donné que Mid2-iRFP est distribuée sur toute la membrane du RE, tandis que Gas1-GFP est concentrée et rassemblée dans les zones discontinues de cette membrane, leur distribution est totalement différente (Figure 1, A à C et Vidéo S1). De plus, comme le montre la figure 1D, le cluster Gas1-GFP ne contient pas de Mid2-iRFP. Ces résultats indiquent que les protéines GPI-AP et transmembranaires ont été séparées précocement dans différentes régions membranaires du RE. Le cluster Gas1-GFP est adjacent à un ERES spécifique marqué par la protéine de capside COPII Sec13 de mCherry (figure 1, E et F, et vidéo S1) (23).
Les cellules sec31-1 expriment des sécrétions induites par le galactose, un céramide à longue chaîne acyle (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, vert) et la protéine transmembranaire Mid2-iRFP (TMP, bleu). Ce marquage ERES constructif Sec13-mCherry (ERES, magenta) a été réalisé après incubation à 37 °C pendant 30 minutes, puis transfert à 24 °C et imagerie par SCLIM 5 minutes plus tard. Les figures (A à C) présentent respectivement une image 2D unique ou fusionnée d'un plan (A), une image de projection 2D de 10 coupes z (B) et une image 3D d'un hémisphère cellulaire montrant le cargo et les marqueurs ERES (C). Échelle : 1 µm (A et B). Unité d'échelle : 0,551 µm (C). Gas1-GFP a été détecté dans des régions ou des amas discrets du RE, tandis que Mid2-iRFP a été détecté et distribué sur toute la membrane du RE (C). (D) Le graphique montre l'intensité de fluorescence relative de Gas1-GFP et Mid2-iRFP dans l'amas de Gas1-GFP le long de la flèche blanche (à gauche). UA : unité arbitraire. (E et F) représentent l'image 3D combinant la protéine et le marqueur ERES. Des amas de Gas1-GFP ont été détectés à proximité de l'ERES spécifique. L'échelle est de 0,551 µm. (F) La flèche blanche pleine indique l'amas de Gas1-GFP associé à l'ERES. Les panneaux du milieu et de droite montrent l'image 3D agrandie fusionnée et une vue pivotée de l'amas de Gas1-GFP sélectionné.
La proximité spatiale entre le cluster Gas1-GFP et un ERES spécifique indique que Gas1-GFP peut pénétrer dans des ERES sélectifs, contrairement à la sélectivité utilisée par Mid2-iRFP pour quitter le RE. Afin d'explorer cette possibilité, nous avons quantifié le ratio d'ERES contenant un ou deux composants seulement (Figure 2, A à C). Nous avons constaté que la plupart des ERES (70 %) ne contiennent qu'un seul type de cargaison. L'image du bas de la Figure 2C illustre deux exemples typiques d'ERES contenant uniquement Gas1-GFP (Figure 1) ou uniquement Mid2-iRFP (Figure 2). En revanche, environ 20 % des ERES contiennent deux cargaisons qui se chevauchent dans la même zone. Certains ERES (10 %) contiennent deux types de cargaison, mais celles-ci sont isolées dans des zones distinctes. Ainsi, cette analyse statistique montre qu'après leur exportation du RE, la protéine GPI-AP Gas1-GFP et la cargaison transmembranaire Mid2-iRFP sont réparties dans différents ERES (Figure 2D). Cette efficacité de tri est parfaitement cohérente avec les analyses biochimiques (6) et morphologiques (7) précédentes. Nous pouvons également observer le comportement des protéines mises en quarantaine lors de leur entrée dans l'ERES (Figure 2E et Vidéo S2). La Figure 2E montre que seule une petite partie de Gas1-GFP (panneau 3) ou de Mid2-iRFP (panneau 4) pénètre dans l'ERES par un seul côté et se retrouve confinée dans une zone distincte. Le panneau 5 de la Figure 2E montre que Gas1-GFP et Mid2-iRFP sont parfois présents dans le même ERES, mais qu'ils y pénètrent par des côtés différents et se concentrent dans des régions distinctes qui pourraient correspondre à différentes vésicules COPII. Nous avons également confirmé que la séparation et la classification observées de Gas1, une protéine GPI-AP à base de céramide C26, en tant qu'ERES sélectif sont spécifiques, car une autre protéine de sécrétion transmembranaire, la protéine membranaire plasmique Axl2 marquée par la GFP (27), présente un comportement similaire à celui de Mid2-iRFP (Figure S1 et Vidéo S3). La protéine Axl2-GFP nouvellement synthétisée est distribuée à travers la membrane du réticulum endoplasmique (RE) comme Mid2-iRFP (Figure S1, A et B), et est colocalisée avec Mid2-iRFP dans la plupart des ERES (Figure S1, B à D). Les panneaux 1 et 2 de la Figure 1.S1C montrent deux exemples typiques d'ERES où deux cargaisons transmembranaires se chevauchent. Dans ces cas, les deux cargaisons pénètrent simultanément dans l'ERES (Figure S1E, panneau 3 et Vidéo S3).
Les cellules sec31-1 exprimant les sécrétions inductibles par le galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, vert) et Mid2-iRFP (TMP, bleu), ainsi que le marquage ERES constitutif Sec13-mCherry (ERES, magenta), ont été incubées à 37 °C pendant 30 minutes, puis transférées à 24 °C pour lever le blocage de la sécrétion. L'imagerie SCLIM a été réalisée 20 minutes plus tard. (A à C) Images représentatives de projections 2D (A ; échelle : 1 µm) ou d'hémisphères cellulaires 3D (B et C ; échelle : 0,456 µm) de la cargaison et de 10 sections z marquées par ERES. Le panneau inférieur de (B) et le panneau supérieur de (C) présentent des images traitées ne montrant que les cargaisons présentes dans ERES (magenta) [Gas1-GFP (gris) et Mid2-iRFP (bleu clair)]. (C) Flèche ouverte : ERES ne transporte qu’une seule molécule (1 à 4). Flèche grise : ERES contient une molécule ségréguée (5). Flèche blanche pleine : ERES contenant une molécule colocalisée. Ci-dessous : L’ERES sélectionné contient uniquement Gas1-GFP (1) ou Mid2-iRFP (2). Échelle : 100 nm. (D) Quantification de la photomicrographie décrite en (C). Pourcentage moyen d’ERES contenant une seule molécule (Gas1-GFP ou Mid2-iRFP), une molécule ségréguée et une molécule chevauchante. Dans trois expériences indépendantes, n = 432 dans 54 cellules. Barre d’erreur = écart-type. Test t bilatéral non apparié. *** p = 0,0002. (E) Image 3D de l’ERES sélectionné contenant la molécule mise en quarantaine et marquée en (C). Gas1-GFP (vert) (3) ou Mid2-iRFP (bleu) (4) pénètre dans l’ERES (magenta) par un côté et est confiné à une petite zone à l’intérieur de l’ERES. Parfois, les deux types de cargaison pénètrent dans le même ERES (5) du même côté et sont confinés dans une zone isolée à l'intérieur de l'ERES. Échelle : 100 nm.
Nous avons ensuite testé l'hypothèse selon laquelle la céramide à longue chaîne acyle (C26) présente dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE) induit le regroupement et le tri spécifiques de Gas1 dans des ERES sélectifs. À cette fin, nous avons utilisé une souche de levure modifiée, GhLag1, dans laquelle les deux céramide synthases endogènes Lag1 et Lac1 ont été remplacées par GhLag1 (l'homologue de Lag1 chez le coton), ce qui a permis d'obtenir une souche de levure dont la membrane cellulaire contient moins de céramides que celle de la souche sauvage (Figure 3A) (28). L'analyse par spectrométrie de masse (SM) a montré que chez les souches sauvages, 95 % des céramides totaux sont des céramides à très longue chaîne (C26), tandis que chez GhLag1, 85 % des céramides sont des céramides à très longue chaîne (C18 et C16). Bien que les céramides C18 et C16 soient les principaux céramides détectés jusqu'à présent dans la membrane de GhLag1, l'analyse par spectrométrie de masse a également confirmé que l'ancre GPI de Gas1-GFP, exprimée dans la souche GhLag1, contient du céramide C26, comparable aux lipides de type sauvage. La qualité est identique (Fig. 3A) (26). Par conséquent, cela signifie que l'enzyme de remodelage des céramides Cwh43 est hautement sélective pour le céramide C26, comme le montre la figure 26 : elle incorpore préférentiellement l'ancre GPI à partir d'une faible quantité de céramide C26 présente dans la souche GhLag1. S2 (29). Néanmoins, la membrane cellulaire de GhLag1 ne contient pratiquement que des céramides C18-C16, tandis que Gas1-GFP possède encore du céramide C26. Ce fait fait de cette souche un outil idéal pour résoudre spécifiquement le problème de la longueur de la chaîne acyle des céramides membranaires dans le RE. Rôle hypothétique de la classe et du tri. Nous avons d'abord étudié la capacité de Gas1-GFP C26 à s'accumuler en amas dans GhLag1, porteur d'un allèle mutant thermosensible de sec31-1, par microscopie de fluorescence conventionnelle. Dans cette souche, seule la longue chaîne (C18-C16) est présente dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE) (Fig. 3). Nous avons observé que dans sec31-1, la majeure partie de Gas1-GFP était concentrée en amas, tandis que dans GhLag1 sec31-1, présentant une membrane du RE à longue chaîne de céramide (C18-C16), Gas1-GFP était principalement dispersé dans toute la membrane du RE, sans agrégats. Plus précisément, étant donné que l'agrégation basée sur le céramide C26 est étroitement liée à des ERES spécifiques (Figure 1), nous avons ensuite examiné si ce processus pouvait également impliquer le mécanisme d'exportation des protéines du RE. GPI-AP utilise un système COPII spécifique pour l'exportation du RE, activement régulé par le remodelage structural de la partie glycanique de l'ancre GPI par Ted1 (30, 31). Le GPI-glycane recombinant est ensuite reconnu par le complexe récepteur de cargaison transmembranaire p24, qui recrute sélectivement Lst1, une isoforme spécifique de la sous-unité majeure de liaison à la cargaison COPII, Sec24, formant ainsi des vésicules COPII riches en GPI-AP (31-33). Par conséquent, nous avons construit un double mutant combinant la délétion de ces protéines (le composant du complexe p24, Emp24, l'enzyme de remodelage du GPI-glycane, Ted1, et la sous-unité spécifique COPII, Lst1) avec la souche mutante sec31-1, et nous avons étudié la possibilité de former des clusters Gas1-GFP (Figure 3). Nous avons observé que dans les mutants sec31-1emp24Δ et sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP est principalement non agrégé et distribué dans toute la membrane du RE, comme précédemment observé dans sec31-1 GhLag1, tandis que dans sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP est similaire à sec31-1. Ces résultats indiquent qu'en plus de la présence de céramide C26 dans la membrane du RE, l'agrégation de Gas1-GFP nécessite également sa liaison au complexe p24 et ne requiert pas le recrutement spécifique de Lst1. Nous avons ensuite exploré l'hypothèse selon laquelle la longueur de la chaîne de céramide dans la membrane du RE pourrait réguler la liaison de Gas1-GFP à p24. Cependant, nous avons constaté que la présence de céramide C18-C16 dans la membrane n'affecte ni les GPI-glycanes reconstitués par le complexe p24 (figures S3 et S4, A et B), ni la liaison aux GPI-AP, ni la capacité d'exportation des GPI-AP. Le recrutement du sous-type COPII de Lst1 n'est pas non plus requis (figure S4C). Par conséquent, l'agrégation dépendante du céramide C26 ne nécessite pas d'interactions protéiques avec différents mécanismes d'exportation du RE, mais soutient un mécanisme de tri alternatif piloté par la longueur des lipides. Nous avons ensuite analysé si la longueur de la chaîne acyle du céramide dans la membrane du RE est importante pour la classification efficace de Gas1-GFP en tant qu'ERES sélectif. Étant donné que Gas1, dans la souche GhLag1 présentant une céramide à chaîne courte, quitte le réticulum endoplasmique et pénètre dans la membrane plasmique (Figure S5), nous pensons que si le tri est déterminé par la longueur de la chaîne acyle de la céramide, Gas1, dans la souche GhLag1, peut être redirigé et traverser la membrane plasmique.
(A) La membrane cellulaire de GhLag1 contient principalement des céramides C18-C16 plus courts, tandis que l'ancre GPI de Gas1-GFP conserve le même IPC C26 que les cellules de type sauvage. En haut : analyse de la longueur de la chaîne acyle des céramides dans la membrane cellulaire des souches de type sauvage (Wt) et GhLag1p par spectrométrie de masse (SM). Les données représentent le pourcentage de céramides totaux. Moyenne de trois expériences indépendantes. Barre d'erreur = écart-type. Test t bilatéral non apparié. **** P < 0,0001. En bas : analyse SM de la longueur de la chaîne acyle de l'IPC présent dans l'ancre GPI de Gas1-GFP (GPI-IPC) exprimée dans les souches de type sauvage et GhLag1p. Les données représentent le pourcentage du signal IPC total. Moyenne de cinq expériences indépendantes. Barre d'erreur = écart-type. Test t bilatéral non apparié. ns, non significatif. P = 0,9134. (B) Micrographies de fluorescence de cellules sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ et sec31-1lst1Δ exprimant Gas1-GFP induit par le galactose. Ces cellules ont été incubées à 37 °C pendant 30 minutes, puis transférées à 24 °C pour une observation de fluorescence de routine. Flèche blanche : agrégat de Gas1-GFP dans le RE. Flèche ouverte : Gas1-GFP non agrégé est réparti sur toute la membrane du RE, montrant la coloration annulaire nucléaire caractéristique du RE. Échelle : 5 μm. (C) Quantification de la photomicrographie décrite en (B). Pourcentage moyen de cellules présentant une structure ponctuée de Gas1-GFP. Dans trois expériences indépendantes, n ≥ 300 cellules. Barre d’erreur = écart-type. Test t bilatéral non apparié. **** P < 0,0001.
Pour résoudre directement ce problème, nous avons réalisé une visualisation SCLIM de Gas1-GFP et Mid2-iRFP dans GhLag1 avec l'allèle mutant thermosensible sec31-1 (Figure 4 et Vidéo S4). Après maintien du RE à 37 °C puis sa libération à 24 °C, la majeure partie du Gas1-GFP nouvellement synthétisé n'était pas agrégée et était distribuée dans toute la membrane du RE, comme observé par microscopie conventionnelle (Figure 4, A et B). De plus, un pourcentage important d'ERES (67 %) contenait deux types de cargaisons colocalisées (Figure 4D). Les panneaux 1 et 2 de la Figure 4C montrent deux exemples typiques d'ERES avec Gas1-GFP et Mid2-GFP se chevauchant. De plus, les deux cargaisons étaient recrutées dans le même ERES (Figure 4E, panneau 3 et Vidéo S4). Par conséquent, nos résultats indiquent que la longueur de la chaîne acyle du céramide dans la membrane du RE est un déterminant important de l'agrégation et de la classification des protéines du RE.
Cellules Sec31-1 GhLag1 exprimant les sécrétions induites par le galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, vert) et Mid2-iRFP (TMP, bleu), ainsi que Sec13-mCherry marqué constitutif par ERES (ERES, magenta). Incuber à 37 °C pendant 30 minutes, puis abaisser la température à 24 °C pour libérer les sécrétions et imager par SCLIM après 20 minutes. (A à C) Images de projection 2D représentatives (A ; échelle : 1 µm) ou images 3D d'hémisphères cellulaires (B et C ; échelle : 0,45 µm) des 10 sections z marquées par le cargo et l'ERES. Le panneau inférieur de (B) et le panneau supérieur de (C) présentent des images traitées ne montrant que les marchandises présentes dans l'ERES (magenta) [Gas1-GFP (gris) et Mid2-iRFP (bleu clair)]. (C) Flèche blanche pleine : ERES, chevauchement de marchandises. Flèche vide : ERES ne contient qu’un seul élément. Panneau inférieur : L’ERES sélectionné présente des marchandises chevauchantes (1 et 2) marquées en (C). Échelle : 100 nm. (D) Quantification de la photomicrographie décrite en (C). Dans les unités sec31-1 et sec31-1 GhLag1, une seule cargaison (Gas1-GFP ou Mid2-iRFP) est incluse, et le pourcentage moyen d’ERES pour les cargaisons isolées et les cargaisons chevauchantes est indiqué. Dans trois expériences indépendantes, n = 432 dans 54 cellules (sec31-1) et n = 430 dans 47 cellules (sec31-1 GhLag1). Barre d’erreur = écart-type. Test t bilatéral non apparié. *** P = 0,0002 (sec31-1) et ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Image 3D de l'ERES sélectionné avec chevauchement de la cargaison (3) marquée en (C). Gas1-GFP (vert) et Mid2-iRFP (bleu) s'approchent de l'ERES (magenta) du même côté et restent dans la même zone restreinte de l'ERES. Échelle : 100 nm.
Cette étude apporte la preuve directe in vivo que les protéines lipidiques sont classées dans des sites d'exportation sélectifs au sein de la voie de sécrétion, et révèle l'importance de la longueur de la chaîne acyle pour cette sélectivité. Grâce à une technique de microscopie puissante et de pointe appelée SCLIM, nous avons démontré que la protéine Gas1-GFP (une GPI-AP membranaire majeure possédant une très longue chaîne acyle (C26) de type céramide) nouvellement synthétisée chez la levure présente des régions regroupées dans des réticulums endoplasmiques (RE) distincts, associés à des sites d'exportation spécifiques (ERES), tandis que les protéines transmembranaires sécrétées sont distribuées sur toute la membrane du RE (Figure 1). De plus, ces deux types de protéines pénètrent sélectivement dans différents ERES (Figure 2). Lorsque la longueur de la chaîne acyle du céramide membranaire diminue de C26 à C18-C16, le groupement Gas1-GFP se disperse dans la région du RE et Gas1-GFP est redirigé pour quitter le RE avec la protéine transmembranaire via le même ERES (Figures 3 et 4).
Bien que GPI-AP utilise un mécanisme protéique spécialisé pour quitter le RE, nous avons constaté que la séparation dépendante du céramide C26 ne repose pas sur des interactions protéiques différentielles susceptibles d'induire une spécialisation des ERES (figures S4 et S5). Nos résultats soutiennent plutôt un mécanisme de classification alternatif, piloté par l'agrégation de protéines à base de lipides et l'exclusion subséquente d'autres cargaisons. Nos observations indiquent que la région ou l'agrégat Gas1-GFP associé à un ERES spécifique est dépourvu de la protéine transmembranaire sécrétée Mid2-iRFP, ce qui suggère que l'agrégat GPI-AP dépendant du céramide C26 facilitera leur entrée dans l'ERES concerné, tout en excluant les protéines transmembranaires sécrétées (figures 1 et 2). En revanche, la présence de céramides C18-C16 dans la membrane du RE n'induit pas la formation de régions ou d'agrégats GPI-AP ; par conséquent, ces derniers n'excluent ni ne remplacent les protéines transmembranaires sécrétées dans le même ERES (figures 3 et 4). Par conséquent, nous proposons que le céramide C26 favorise la séparation et la classification en facilitant le regroupement des protéines liées à des ERES spécifiques.
Comment parvenir à cette agrégation dépendante du céramide C26 dans une zone spécifique du RE ? La tendance du céramide membranaire à se séparer latéralement pourrait entraîner la formation de petits agrégats lipidiques instantanément ordonnés entre le GPI-AP et le céramide C26 dans l’environnement lipidique plus irrégulier de la membrane du RE, contenant des glycérolipides plus courts et insaturés. Ces agrégats de qualité (17, 18) peuvent fusionner pour former des agrégats plus grands et plus stables après liaison au complexe p24 (34). Conformément à cela, nous avons montré que le C26 Gas1-GFP doit interagir avec le complexe p24 pour former des agrégats visibles plus grands (Figure 3). Le complexe p24 est un oligomère hétérozygote composé de quatre protéines transmembranaires p24 différentes chez la levure (35), qui assure une liaison multivalente. Cette liaison peut conduire à la réticulation de petits agrégats de GPI-AP, générant ainsi des agrégats stables plus grands (34). L'interaction entre les ectodomaines protéiques des GPI-AP pourrait également contribuer à leur agrégation, comme observé lors de leur transport golgien dans les cellules épithéliales polarisées de mammifères (36). Cependant, en présence de céramide C18-C16 dans la membrane du RE, la liaison du complexe p24 à Gas1-GFP n'entraîne pas la formation de grands agrégats distincts. Le mécanisme sous-jacent pourrait dépendre des propriétés physico-chimiques spécifiques de la longue chaîne acyle du céramide. Des études biophysiques sur des membranes artificielles montrent que, bien que les céramides à longue (C24) et courte (C18-C16) chaîne acyle puissent induire une séparation de phases, seuls les céramides à longue chaîne acyle (C24) favorisent une forte courbure et une déformation du film, permettant ainsi son remodelage. (17, 37, 38). Il a été démontré que l'hélice transmembranaire de TMED2, l'homologue humain d'Emp24, interagit sélectivement avec la sphingomyéline à base de céramide C18 dans les lobules cytoplasmiques (39). À l'aide de simulations de dynamique moléculaire (DM), nous avons constaté que les céramides C18 et C26 s'accumulent autour des lobules cytoplasmiques de l'hélice transmembranaire d'Emp24 et présentent des affinités similaires (Figure S6). Il est important de noter que cela indique que l'hélice transmembranaire d'Emp24 peut induire une distribution asymétrique des lipides dans la membrane. Ce résultat, récemment obtenu sur des cellules de mammifères, est à noter. Des simulations de DM similaires montrent également la présence d'éther-lipides (40). Par conséquent, nous supposons que le céramide C26 est localement enrichi dans les deux lobules d'ER26. Lorsque le GPI-AP présent dans les lobules luminaux se lie directement à la protéine p24 multivalente et que l'accumulation de céramide C26 autour de p24 dans les lobules cytoplasmiques favorise l'agrégation protéique et la courbure membranaire induites par les doigts de GPI-AP (41), entraînant la séparation du GPI-AP en régions distinctes adjacentes à l'ERES, ce qui favorise également les régions fortement courbées de la membrane du RE (42). Des études antérieures ont confirmé ce mécanisme (43, 44). La liaison multivalente d'oligolectines, de pathogènes ou d'anticorps aux glycosphingolipides (GSL) à base de céramide de la membrane plasmique déclenche une importante agrégation des GSL, accentue la séparation de phases et provoque une déformation et une internalisation de la membrane (44). Iwabuchi et al. (43) Il a été constaté qu'en présence de longues chaînes acyles (C24) mais pas de courtes (C16), le ligand multivalent lié au GSL lactosylcéramide induisait la formation de grands amas et une invagination membranaire, et la transduction du signal médiée par Lyn dans le cytoplasme sur les feuillets est interdigitée par les chaînes acyles dans les neutrophiles couplés.
Dans les cellules épithéliales polarisées de mammifères, la concentration du réseau anti-Golgi (TGN) au niveau de la membrane plasmique apicale contrôle la séparation et le tri des GPI-AP (10, 45). Cette agrégation est induite par l'oligomérisation des GPI-AP (36), mais elle pourrait également dépendre de la longueur de la chaîne de céramide présente chez la levure. Bien que les GPI-AP de mammifères possèdent un ancrage à base d'éther lipidique et que leur structure chimique soit très différente de celle des céramides à très longue chaîne acyle, une étude récente a montré que ces deux lipides présentent des propriétés physico-chimiques et une fonction similaires d'un point de vue évolutif (40). Par conséquent, la partie éther lipidique des cellules de mammifères pourrait être similaire au céramide C26 de la levure, et son rôle serait de s'associer aux céramides à longue chaîne de la membrane pour favoriser l'agrégation et le tri des GPI-AP. Bien que cette hypothèse reste à vérifier directement, des résultats antérieurs suggèrent que le transport des céramides à longue chaîne acyle vers l'appareil de Golgi n'est pas assuré par des protéines de transfert cytoplasmiques, mais dépend de la synthèse d'ancres GPI, comme chez la levure. Par conséquent, ce mécanisme, conservé au cours de l'évolution, semble capable de co-transporter sélectivement des céramides à très longue chaîne acyle et des GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) dans une même vésicule de transport.
Chez la levure et les cellules épithéliales polarisées de mammifères, l'agrégation et la séparation des GPI-AP des autres protéines membranaires se produisent avant qu'elles n'atteignent la surface cellulaire. Paladino et al. (48) ont découvert que sur le TGN des cellules épithéliales polarisées de mammifères, le regroupement des GPI-AP est non seulement nécessaire à leur ciblage apical de la membrane plasmique, mais régule également leur organisation et leur activité biologique. Chez la levure, cette étude a montré que le regroupement de GPI-AP dépendant du céramide C26 sur le RE peut réguler l'organisation et l'activité fonctionnelle des GPI-AP à la surface de la membrane plasmique (24, 49). Conformément à ce modèle, les cellules GhLag1 sont sensibles aux inhibiteurs de GPI ou aux médicaments affectant l'intégrité de la paroi cellulaire (28), et la nécessité de regroupements fonctionnels de Gas1-GFP (49) au niveau du céramide apical projeté lors de l'accouplement des cellules de levure suggère des conséquences physiologiques possibles de l'erreur des GPI-AP dans les cellules hLag1. Cependant, nos recherches futures porteront sur la vérification, par une méthode de tri basée sur la longueur des lipides, de la programmation de l'organisation fonctionnelle de la surface cellulaire à partir du RE.
Les souches de Saccharomyces cerevisiae utilisées dans ce travail sont listées dans le Tableau S1. Les souches MMY1583 et MMY1635 de SCLIM, utilisées pour l'imagerie cellulaire en temps réel, ont été construites sur le fond génétique de W303. Ces souches, exprimant Sec13-mCherry marqué par une protéine fluorescente, ont été construites par PCR à partir du plasmide pFA6a (23). La souche exprimant Mid2-iRFP marqué par une protéine fluorescente sous le contrôle du promoteur GAL1 a été construite comme suit : amplification par PCR de la séquence iRFP-KanMx à partir du vecteur pKTiRFP-KAN (don d'E. O'Shea, plasmide Addgene n° 64687 ; http://n2t.net/addgene:64687 ; identifiant de ressource de recherche (RRID) : Addgene_64687) et insertion à l'extrémité C-terminale de Mid2 endogène. Après amplification et clonage de la séquence génomique Mid2-iRFP dans le promoteur GAL1, celle-ci a été intégrée au site Not I-Sac I du plasmide d'intégration pRS306. Le plasmide pRGS7 résultant a été linéarisé avec Pst I pour s'intégrer au locus URA3.
Le gène de fusion Gas1-GFP est exprimé sous le contrôle du promoteur GAL1 dans le plasmide centromérique (CEN), construit comme suit. La séquence Gas1-GFP a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pRS416-GAS1-GFP (24) (don de L. Popolo) et clonée dans le site Xma I–Xho I du plasmide CEN pBEVY-GL LEU2 (don de C. Miller ; numéro de plasmide Addgene : 51225 ; http://n2t.net/addgene:51225 ; RRID : Addgene_51225). Le plasmide obtenu a été nommé pRGS6. Le gène de fusion Axl2-GFP est également exprimé sous le contrôle du promoteur GAL1 du vecteur pBEVY-GL LEU2, et sa construction est décrite ci-après. La séquence Axl2-GFP a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) et clonée dans le site BamHI-PstI du vecteur pBEVY-GL LEU2. Le plasmide obtenu a été nommé pRGS12. La séquence des oligonucléotides utilisés dans cette étude est présentée dans le tableau S2.
La souche a été supplémentée avec 0,2 % d'adénine et 2 % de glucose [YP-dextrose (YPD)], 2 % de raffinose [YP-raffinose], un milieu riche en extrait de levure et protéines (YP) (1 % d'extrait de levure et 2 % de protéines) [YP-protéines (YPR)] ou 2 % de galactose [YP-galactose (YPG)] comme source de carbone, ou dans un milieu minimal synthétique (0,15 % de base azotée pour levure et 0,5 % de sulfate d'ammonium) pour fournir les acides aminés et les bases nécessaires à sa nutrition, et contenant 2 % de glucose (milieu minimal synthétique au glucose) ou 2 % de galactose (milieu minimal synthétique au galactose) comme source de carbone.
Pour l'imagerie en temps réel, des cellules mutantes sec31-1 thermosensibles exprimant la construction sous le contrôle du promoteur GAL1 ont été cultivées dans un milieu YPR à 24 °C pendant une nuit jusqu'à la phase de croissance exponentielle moyenne. Après induction dans un milieu YPG à 24 °C pendant 1 heure, les cellules ont été incubées dans un milieu SG à 37 °C pendant 30 minutes, puis transférées à 24 °C pour lever le blocage de la sécrétion. La concanavaline A a été utilisée pour fixer les cellules sur une lame de verre et imagées par SCLIM. SCLIM est un système combinant un microscope à fluorescence inversé Olympus IX-71 et un objectif à immersion d'huile UPlanSApo 100×1,4 (Olympus), un scanner confocal à disque rotatif haute vitesse et à rapport signal/bruit élevé (Yokogawa Electric), un spectromètre et un système de refroidissement personnalisés. L'intensificateur d'image (Hamamatsu Photonics) permet d'obtenir un grossissement final de ×266,7 et une caméra CCD multipliant les électrons (Hamamatsu Photonics) (21). L'acquisition d'images est réalisée par un logiciel personnalisé (Yokogawa Electric). Pour les images 3D, un actionneur piézoélectrique sur mesure permet de faire vibrer verticalement l'objectif et de collecter les parties optiques espacées de 100 nm. L'image de la pile Z est convertie en données voxel 3D, et la fonction d'étalement du point théorique utilisée pour le microscope confocal à disque rotatif est employée pour la déconvolution par le logiciel Volocity (PerkinElmer). L'analyse de colocalisation a été réalisée à l'aide du logiciel Volocity, qui a permis de définir automatiquement le seuil. L'analyse par balayage linéaire a été effectuée avec le logiciel MetaMorph (Molecular Devices).
Utilisez le logiciel GraphPad Prism pour déterminer la significativité statistique. Pour le test t de Student bilatéral et l'analyse de variance (ANOVA) à un facteur, les différences entre les groupes sont considérées comme significatives pour P < 0,05 (*).
Pour la microscopie à fluorescence de Gas1-GFP, les cellules en phase exponentielle de croissance ont été cultivées pendant une nuit dans du milieu YPD, puis collectées par centrifugation, lavées deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate et incubées sur glace pendant au moins 15 minutes. L’observation au microscope a ensuite été réalisée comme décrit précédemment (24). Le microscope Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) équipé d’un objectif, d’un filtre L5 (GFP), d’une caméra Hamamatsu et du logiciel Application Suite X (LAS X) a été utilisé pour l’acquisition des images.
Les échantillons ont été dénaturés avec un tampon de lyse SDS à 65 °C pendant 10 minutes, puis séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE). Pour l'analyse par immunoblot, 10 μl d'échantillon ont été déposés par puits. Anticorps primaires : anticorps polyclonal de lapin anti-Gas1 à une dilution de 1/3000, anticorps polyclonal de lapin anti-Emp24 à une dilution de 1/500 et anticorps polyclonal de lapin anti-GFP (don de H. Riezman) à une dilution de 1/3000. L'anticorps monoclonal de souris anti-Pgk1 a été utilisé à une dilution de 1/5000 (don de J. de la Cruz). Anticorps secondaire : immunoglobuline G (IgG) de chèvre anti-lapin conjuguée à la peroxydase de raifort (HRP) à une dilution de 1/3000 (Pierce). L'anticorps secondaire de chèvre anti-souris IgG conjugué à la peroxydase (HRP) a été utilisé à une dilution de 1:3000 (Pierce). La zone de réponse immunitaire a été observée par chimiluminescence à l'aide du réactif SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Comme décrit dans (31), une expérience d'immunoprécipitation naturelle a été réalisée sur la fraction ER enrichie. Brièvement, les cellules de levure ont été lavées deux fois avec du tampon TNE [Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, fluorure de phénylméthylsulfonyle 1 mM et un mélange d'inhibiteurs de protéases] à 600 nm (DO₆₀₀) à une densité optique de 100. Elles ont ensuite été lysées avec des billes de verre, puis les débris cellulaires et les billes de verre ont été éliminés par centrifugation. Le surnageant a ensuite été centrifugé à 17 000 g pendant 15 minutes à 4 °C. Le culot a été remis en suspension dans du tampon TNE et de la saponine digitalique a été ajoutée à une concentration finale de 1 %. La suspension a été incubée pendant 1 heure sous agitation à 4 °C, puis les composants insolubles ont été éliminés par centrifugation à 13 000 g à 4 °C pendant 60 minutes. Pour l'immunoprécipitation de Gas1-GFP, pré-incuber l'échantillon avec des billes d'agarose vides (ChromoTek) à 4 °C pendant 1 heure, puis avec GFP-Trap_A (ChromoTek) à 4 °C pendant 3 heures. Les billes immunoprécipitées sont lavées cinq fois avec du tampon TNE contenant 0,2 % de digoxigénine, éluées avec un tampon d'échantillon SDS, séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE) et analysées par immunoblot.
Comme décrit dans (31), la détermination de la réticulation a été réalisée sur la fraction ER enrichie. Brièvement, cette fraction a été incubée avec 0,5 mM de dithiobis(succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, États-Unis ; 20 °C, 20 min). La réaction de réticulation a été stoppée par l’ajout de glycine (concentration finale de 50 mM, 5 min, 20 °C).
Comme décrit précédemment (50), l'analyse par spectrométrie de masse (SM) du céramide a été réalisée sur les souches sauvage et GhLag1. Brièvement, les cellules ont été cultivées jusqu'à la phase exponentielle (DO₆₀₀ de 3 à 4 unités/ml) dans du milieu YPD à 30 °C, puis 25 × 10⁷ cellules ont été récoltées. Leur métabolisme a été bloqué par l'acide trichloroacétique. Un solvant d'extraction [éthanol, eau, éther, pyridine et hydroxyde d'ammonium 4,2 N (15:15:5:1:0,018 v/v)] et 1,2 nmol de céramide C17 (860517, Avanti polar lipid) ont été utilisés comme étalon interne. L'extrait a ensuite subi une hydrolyse alcaline douce avec un réactif de monométhylamine [méthanol, eau, n-butanol et solution de méthylamine (4:3:1:5 v/v)], suivie d'un dessalage avec du n-butanol saturé en eau. L'extrait a ensuite été remis en suspension dans un solvant en mode positif [chloroforme/méthanol/eau (2:7:1) + acétate d'ammonium 5 mM] et injecté dans le spectromètre de masse. La surveillance des réactions multiples (MRM) a été utilisée pour l'identification et la quantification des sphingolipides. Le spectromètre de masse à triple quadripôle TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) est équipé d'une source d'ions nanoflux robotisée Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) pour l'analyse des lipides. L'énergie de collision est optimisée pour chaque catégorie de céramide. Les données de spectrométrie de masse ont été acquises en mode positif. Pour chaque réplicat biologique, le signal lipidique correspond à la médiane de trois mesures indépendantes.
Comme décrit dans (31), les cellules (800×10⁷) exprimant Gas1-GFP ont été soumises à une immunoprécipitation naturelle. La protéine Gas1-GFP purifiée a été séparée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE) et transférée sur une membrane de polyfluorure de vinylidène (PVDF). La protéine a été visualisée par coloration de la membrane PVDF au noir amide. La bande Gas1-GFP a été excisée de la membrane PVDF et lavée 5 fois au méthanol, puis une fois à l'eau de qualité LC-MS. L'incubation de la bande membranaire avec 500 μl de tampon NaOAc 0,3 M (pH 4,0) et 500 μl d'une solution de nitrite de sodium 1 M fraîchement préparée, à 37 °C pendant 3 heures, a permis de libérer la fraction lipidique de Gas1-GFP et de lyser les cellules. La libération d'inosine phosphate céramide entre la glucosamine et l'inositol (51) a également été observée. Après cela, la bandelette de membrane a été lavée quatre fois avec de l'eau de qualité LC-MS, séchée à température ambiante et conservée sous atmosphère d'azote à -80 °C jusqu'à l'analyse. Un échantillon vierge de membrane PVDF a servi de témoin pour chaque expérience. Les lipides extraits de Gas1-GFP ont ensuite été analysés par spectrométrie de masse (SM) comme décrit précédemment (50). Brièvement, les bandelettes de PVDF contenant le GPI-lipide ont été remises en suspension dans 75 μl de solvant pour l'analyse négative [chloroforme/méthanol (1:2) + acétate d'ammonium 5 mM] et analysées par spectrométrie de masse à résonance magnétique (MRM) couplée à l'ionisation par électrospray (ESI) (TSQ Vantage). Les données de SM ont été acquises en mode ion négatif.
Comme mentionné précédemment, la partie lipidique de l'ancre GPI a été séparée du GPI-AP marqué à l'inositol [3H] (16). Les lipides ont été séparés par chromatographie sur couche mince à l'aide d'un système de solvants (55:45:10 chloroforme-méthanol-0,25 % KCl) et visualisés à l'aide de FLA-7000 (Fujifilm).
Les cellules exprimant Gas1-GFP (600 × 10⁷) ont été lavées deux fois avec du tampon TNE, lysées à l'aide de billes de verre, puis centrifugées pour éliminer les débris cellulaires et les billes de verre. Le surnageant a ensuite été centrifugé à 17 000 g pendant 1 heure à 4 °C. Le culot a été lavé dans du tampon TNE et incubé avec 1 U de PI-PLC (Invitrogen) dans du tampon TNE contenant 0,2 % de saponine digitalique pendant 1 heure à 37 °C. Après le traitement enzymatique, la membrane a été éliminée par centrifugation à 17 000 g pendant 1 heure à 4 °C. Pour l'immunoprécipitation de Gas1-GFP, le surnageant a été incubé avec GFP-Trap_A (ChromoTek) à 4 °C pendant une nuit. La protéine Gas1-GFP purifiée, séparée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE), a été colorée au bleu de Coomassie. La bande de marquage Gas1-GFP a été excisée de la zone grise entourant l'aqueduc, puis, après alkylation à l'iodoacétamide et réduction au dithiothréitol, une digestion trypsique in situ a été réalisée. Les peptides trypsiques et les peptides contenant des GPI-glycanes ont été extraits et séchés. Le peptide séché a été dissous dans 20 μl d'eau. Une fraction (8 μl) a été injectée dans le système LC. Une colonne d'octadécylsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5 ; diamètre interne 150 mm × 1,0 mm ; Nomura Chemical, préfecture d'Aichi, Japon) a été utilisée pour séparer les peptides sous gradient de phase mobile. La phase mobile était composée du solvant A (0,08 % d'acide formique) et du solvant B (0,15 % d'acide formique dans 80 % d'acétonitrile). Un système HPLC Accela (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts, États-Unis) a été utilisé pour éluer la colonne avec le solvant A en 55 minutes à un débit de 50 μl/min pendant 5 minutes, puis la concentration du solvant B a été augmentée à 40 %. L'éluat a été introduit en continu dans la source d'ions ESI, et les peptides trypsiques et les peptides contenant des glycanes GPI ont été analysés par spectrométrie de masse LTQ Orbitrap XL (spectromètre de masse hybride à piège d'ions linéaire et Orbitrap ; Thermo Fisher Scientific). Dans la configuration du spectromètre de masse, la tension de la source capillaire a été fixée à 4,5 kV et la température du capillaire de transfert a été maintenue à 300 °C. La tension du capillaire et la tension de la lentille tubulaire ont été fixées respectivement à 15 V et 50 V. Les données MS ont été obtenues en mode ion positif (résolution de 60 000 ; précision de masse de 10 parties par million) dans une gamme de masse de 300/m/z rapport masse/charge (m/z) 3000. Les données MS/MS sont obtenues par le biais du piège à ions du LTQ Orbitrap XL [les 3 premiers chiffres dont dépendent les données, dissociation induite par collision (CID)].
Des simulations de dynamique moléculaire (DM) ont été réalisées à l'aide du logiciel GROMACS (52) et du champ de force MARTINI 2 (53-55). L'interface graphique CHARMM (56, 57) a ensuite été utilisée pour construire une bicouche lipidique contenant de la dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) et du Cer C18 ou de la DOPC et du Cer C26. La topologie et les coordonnées du Cer C26 sont obtenues par DXCE en supprimant les résidus lipidiques supplémentaires de la chaîne sphingosine. La procédure décrite ci-dessous a été utilisée pour équilibrer la double couche et exécuter la simulation. Les coordonnées finales du système ont ensuite servi à construire un système contenant Emp24. Le domaine transmembranaire de la protéine Emp24 de levure (résidus 173 à 193) a été modélisé sous forme d'hélice α à l'aide de l'outil de modélisation moléculaire VMD (58). Après suppression des lipides superposés, la protéine a été granulée grossièrement et insérée dans la bicouche lipidique à l'aide de l'interface graphique CHARMM. Le système final contient 1202 DOPC et 302 Cer C26 ou 1197 DOPC et 295 Cer C18 et Emp24. Ioniser le système à une concentration de 0,150 M. Quatre réplicats indépendants ont été réalisés pour les deux compositions de bicouches.
La bicouche lipidique est équilibrée à l'aide de l'interface graphique CHARMM. Ce processus comprend 405 000 étapes de minimisation puis d'équilibrage, au cours desquelles les contraintes de position sont progressivement réduites puis éliminées, et le pas de temps est augmenté de 0,005 ps à 0,02 ps. Après équilibrage, le système produit une durée de 6 µs avec un pas de temps de 0,02 ps. Après l'insertion de l'élément Emp24, le même processus CHARMM est utilisé pour minimiser et équilibrer le système, puis exécuté pendant 8 s en mode production.
Pour tous les systèmes, lors de l'équilibrage, la pression est régulée par le barostat de Berendsen (59), et lors de la production, par le barostat de Parrinello-Rahman (60). Dans tous les cas, la pression moyenne est de 1 bar et un couplage de pression semi-isotrope est utilisé. Lors de l'équilibrage et de la production, un thermostat (61) à recalibrage rapide permet de coupler respectivement la température des particules de protéine, de lipide et de solvant. Durant toute l'opération, la température cible est de 310 K. L'interaction non covalente est calculée en générant une liste d'appariements selon le schéma de Verlet avec une tolérance de tampon de 0,005. Le terme coulombien est calculé à partir du champ de réaction et d'une distance de coupure de 1,1 nm. Le terme de van der Waals utilise un schéma de coupure avec une distance de coupure de 1,1 nm, et le schéma de coupure de Verlet est utilisé pour la dérive potentielle (62).
En utilisant VMD, la longueur d'onde de coupure entre les billes de phosphate DOPC ou les billes de céramide AM1 et la protéine est de 0,7 nm, et le nombre de lipides interagissant avec la protéine est calculé. Selon la formule suivante, calculer le facteur d'appauvrissement-enrichissement (DE) comme dans (63) : Facteur DE = (quantité totale de lipides dans la protéine × 0,7) / (quantité de céramide dans les lipides totaux).
La valeur indiquée correspond à une moyenne, et les barres d'erreur représentent quatre mesures indépendantes de l'erreur standard. La significativité statistique du facteur DE est calculée par un test t [(moyenne du facteur DE - 1)/erreur standard]. La valeur p est calculée à partir d'une distribution unilatérale.
L'outil GROMACS a été utilisé pour calculer la carte de densité latérale 2D du système contenant Emp24 au cours des 250 dernières nanosecondes de l'enregistrement. Afin d'obtenir la carte d'enrichissement/appauvrissement en céramide, la carte de densité de Cer est divisée par la somme des cartes de Cer et de DOPC, puis par la concentration de Cer dans l'organisme. La même échelle de couleurs est utilisée.
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