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Le sulfure d'hydrogène (H₂S) exerce de multiples effets physiologiques et pathologiques sur l'organisme humain. L'hydrosulfure de sodium (NaHS) est largement utilisé comme outil pharmacologique pour évaluer les effets du H₂S dans les expériences biologiques. Bien que la disparition du H₂S des solutions de NaHS ne prenne que quelques minutes, ces solutions ont été utilisées comme donneurs de H₂S dans l'eau potable lors de certaines études animales. Cette étude a examiné si l'eau potable contenant 30 μM de NaHS, préparée dans des biberons pour rats/souris, pouvait rester stable pendant au moins 12 à 24 heures, comme suggéré par certains auteurs. Une solution de NaHS (30 μM) a été préparée dans de l'eau potable et immédiatement versée dans des biberons pour rats/souris. Des échantillons ont été prélevés à l'extrémité et à l'intérieur du biberon à 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 et 24 heures afin de mesurer la concentration en sulfure par la méthode au bleu de méthylène. De plus, des rats mâles et femelles ont reçu des injections de NaHS (30 μM) pendant deux semaines, et les concentrations de sulfure sérique ont été mesurées tous les deux jours durant la première semaine et à la fin de la seconde. La solution de NaHS prélevée à l'extrémité du biberon s'est avérée instable ; sa concentration a diminué de 72 % et 75 % après respectivement 12 et 24 heures. Dans les échantillons prélevés à l'intérieur des biberons, la diminution de la concentration de NaHS n'était pas significative dans les deux heures suivant l'injection ; cependant, elle a diminué de 47 % et 72 % après respectivement 12 et 24 heures. L'injection de NaHS n'a pas affecté le taux de sulfure sérique chez les rats mâles et femelles. En conclusion, les solutions de NaHS préparées à partir d'eau de boisson ne doivent pas être utilisées pour l'apport de H₂S en raison de leur instabilité. Cette voie d'administration expose les animaux à des quantités de NaHS irrégulières et inférieures aux quantités attendues.
L’hydrogène sulfuré (H2S) est utilisé comme toxine depuis 1700 ; cependant, son rôle possible en tant que molécule de biosignalisation endogène a été décrit par Abe et Kimura en 1996. Au cours des trois dernières décennies, de nombreuses fonctions de H2S dans divers systèmes humains ont été élucidées, ce qui a conduit à la prise de conscience que les molécules donneuses de H2S pourraient avoir des applications cliniques dans le traitement ou la gestion de certaines maladies ; voir Chirino et al. pour une revue récente.
L'hydrosulfure de sodium (NaHS) est largement utilisé comme outil pharmacologique pour évaluer les effets du H₂S dans de nombreuses études cellulaires et animales⁵,⁶,⁷,⁸. Cependant, le NaHS n'est pas un donneur de H₂S idéal car il se convertit rapidement en H₂S/HS⁻ en solution, est facilement contaminé par des polysulfures et s'oxyde et se volatilise facilement⁴,⁹. Dans de nombreuses expériences biologiques, le NaHS est dissous dans l'eau, ce qui entraîne une volatilisation passive et une perte de H₂S¹⁰,¹¹,¹², une oxydation spontanée du H₂S¹¹,¹²,¹³ et une photolyse¹⁴. Le sulfure présent dans la solution initiale disparaît très rapidement par volatilisation du H₂S¹¹. Dans un récipient ouvert, la demi-vie (t₁/₂) du H₂S est d'environ 5 minutes et sa concentration diminue d'environ 13 % par minute¹⁰. Bien que la disparition du sulfure d'hydrogène des solutions de NaHS ne prenne que quelques minutes, certaines études animales ont utilisé des solutions de NaHS comme source de sulfure d'hydrogène dans l'eau de boisson pendant 1 à 21 semaines, en remplaçant la solution contenant du NaHS toutes les 12 à 24 heures.^{15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26} Cette pratique n'est pas conforme aux principes de la recherche scientifique, car les posologies des médicaments doivent être basées sur leur utilisation chez d'autres espèces, notamment chez l'homme.²⁷
La recherche préclinique en biomédecine vise à améliorer la qualité des soins aux patients ou les résultats des traitements. Cependant, les résultats de la plupart des études animales n'ont pas encore été transposés à l'homme^28,29,30. L'une des raisons de cet échec de transposition est le manque d'attention portée à la qualité méthodologique des études animales³⁰. Par conséquent, cette étude visait à déterminer si des solutions de NaHS à 30 μM préparées dans des biberons pour rats/souris pouvaient rester stables dans l'eau de boisson pendant 12 à 24 heures, comme l'affirment ou le suggèrent certaines études.
Toutes les expériences de cette étude ont été menées conformément aux directives publiées en Iran concernant les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire³¹. Tous les rapports expérimentaux de cette étude respectent également les directives ARRIVE³². Le Comité d'éthique de l'Institut des sciences endocriniennes de l'Université des sciences médicales Shahid Beheshti a approuvé tous les protocoles expérimentaux de cette étude.
L’acétate de zinc dihydraté (CAS : 5970-45-6) et le chlorure ferrique anhydre (CAS : 7705-08-0) ont été achetés chez Biochem, Chemopharma (Cosne-sur-Loire, France). L’hydrosulfure de sodium hydraté (CAS : 207683-19-0) et la N,N-diméthyl-p-phénylènediamine (DMPD) (CAS : 535-47-0) ont été achetés chez Sigma-Aldrich (Saint-Louis, Missouri, États-Unis). L’isoflurane a été acheté chez Piramal (Bethlehem, Pennsylvanie, États-Unis). L’acide chlorhydrique (HCl) a été acheté chez Merck (Darmstadt, Allemagne).
Préparer une solution de NaHS (30 μM) dans de l'eau potable et la verser immédiatement dans les biberons des rats/souris. Cette concentration a été choisie d'après de nombreuses publications utilisant le NaHS comme source de H₂S ; voir la section Discussion. Le NaHS est une molécule hydratée pouvant contenir des quantités variables d'eau d'hydratation (NaHS•xH₂O). Selon le fabricant, le pourcentage de NaHS utilisé dans notre étude était de 70,7 % (NaHS•1,3 H₂O), et nous avons tenu compte de cette valeur dans nos calculs, en utilisant une masse molaire de 56,06 g/mol, qui correspond à la masse molaire du NaHS anhydre. L'eau d'hydratation (également appelée eau de cristallisation) est constituée des molécules d'eau qui forment la structure cristalline³³. Les hydrates présentent des propriétés physiques et thermodynamiques différentes de celles des anhydres³⁴.
Avant d'ajouter du NaHS à l'eau de boisson, mesurez le pH et la température du solvant. Versez immédiatement la solution de NaHS dans l'abreuvoir du rat/de la souris, placé dans la cage. Des échantillons ont été prélevés à l'extrémité et à l'intérieur de l'abreuvoir à 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 et 24 h afin de mesurer la teneur en sulfure. Les mesures de sulfure ont été effectuées immédiatement après chaque prélèvement. Nous avons prélevé les échantillons à l'extrémité du tube car certaines études ont montré que la petite taille des pores du tube d'eau peut minimiser l'évaporation du H₂S^15,19. Ce phénomène semble également s'appliquer à la solution contenue dans l'abreuvoir. Cependant, ce n'était pas le cas pour la solution dans le goulot de l'abreuvoir, qui présentait un taux d'évaporation plus élevé et s'auto-oxydante ; en effet, les animaux ont bu cette eau en premier.
Des rats Wistar mâles et femelles ont été utilisés dans cette étude. Les rats étaient logés dans des cages en polypropylène (2 à 3 rats par cage) dans des conditions standard (température : 21–26 °C, humidité : 32–40 %) avec un cycle de 12 h de lumière (de 7 h à 19 h) et 12 h d’obscurité (de 19 h à 7 h). Ils avaient libre accès à l’eau du robinet et étaient nourris avec un aliment standard (Khorak Dam Pars Company, Téhéran, Iran). Des rats Wistar femelles (n = 10, poids corporel : 190–230 g) et mâles (n = 10, poids corporel : 320–370 g), appariés en âge (6 mois), ont été répartis aléatoirement en deux groupes : un groupe témoin et un groupe traité au NaHS (30 µM) (n = 5 par groupe). Pour déterminer la taille de l’échantillon, nous avons utilisé la méthode KISS (Keep It Simple, Stupid), qui combine l’expérience acquise et une analyse de puissance³⁵. Nous avons d'abord mené une étude pilote sur 3 rats afin de déterminer le taux moyen de sulfure total sérique et son écart-type (8,1 ± 0,81 μM). Ensuite, en considérant une puissance de 80 % et un seuil de signification bilatéral de 5 %, nous avons déterminé une taille d'échantillon préliminaire (n = 5, d'après la littérature) correspondant à une taille d'effet standardisée de 2,02, conformément à la valeur prédéfinie proposée par Festing pour le calcul de la taille d'échantillon chez les animaux d'expérience³⁵. Après multiplication de cette valeur par l'écart-type (2,02 × 0,81), la taille d'effet détectable prédite (1,6 μM) était de 20 %, ce qui est acceptable. Cela signifie qu'un effectif de n = 5 par groupe est suffisant pour détecter une variation moyenne de 20 % entre les groupes. Les rats ont été répartis aléatoirement en groupes contrôle et groupes traités au NaSH à l'aide de la fonction aléatoire du logiciel Excel³⁶ (Figure supplémentaire 1). L’insu a été effectué au niveau des résultats, et les chercheurs effectuant les mesures biochimiques n’étaient pas au courant de l’appartenance des participants aux groupes.
Les groupes NaHS des deux sexes ont été traités pendant deux semaines avec une solution de NaHS à 30 μM préparée dans l'eau de boisson. La solution était renouvelée toutes les 24 heures, période durant laquelle le poids corporel était mesuré. Des échantillons de sang ont été prélevés à l'extrémité de la queue de tous les rats sous anesthésie à l'isoflurane, tous les deux jours, à la fin de la première et de la deuxième semaine. Les échantillons de sang ont été centrifugés à 3 000 g pendant 10 minutes, le sérum a été séparé et conservé à –80 °C pour le dosage ultérieur de l'urée, de la créatinine (Cr) et des sulfures totaux sériques. L'urée sérique a été dosée par méthode enzymatique à l'uréase et la créatinine sérique par méthode photométrique de Jaffé, à l'aide de kits commerciaux (Man Company, Téhéran, Iran) et d'un analyseur automatique (Selectra E, numéro de série 0-2124, Pays-Bas). Les coefficients de variation intra- et inter-essais pour l'urée et la Cr étaient inférieurs à 2,5 %.
La méthode au bleu de méthylène (BM) est utilisée pour mesurer la teneur totale en sulfures dans l'eau potable et le sérum contenant du NaHS ; c'est la méthode la plus couramment employée pour le dosage des sulfures dans les solutions en vrac et les échantillons biologiques^11,37. Cette méthode permet d'estimer la teneur totale en sulfures³⁸ et de mesurer les sulfures inorganiques sous forme de H₂S, HS^- et S₂³⁹. Dans cette méthode, le soufre est précipité sous forme de sulfure de zinc (ZnS) en présence d'acétate de zinc^11,38. La précipitation à l'acétate de zinc est la méthode la plus répandue pour séparer les sulfures des autres chromophores¹¹. Le ZnS est ensuite redissous à l'aide d'HCl¹¹ en milieu fortement acide. Le sulfure réagit avec le DMPD dans un rapport stœchiométrique de 1:2, une réaction catalysée par le chlorure ferrique (Fe³⁺ agissant comme agent oxydant), pour former le colorant BM, détecté par spectrophotométrie à 670 nm^40,41. La limite de détection de la méthode MB est d'environ 1 μM11.
Dans cette étude, 100 μL de chaque échantillon (solution ou sérum) ont été introduits dans un tube. On a ensuite ajouté 200 μL d'acétate de zinc (1 % p/v dans de l'eau distillée), 100 μL de DMPD (20 mM dans HCl 7,2 M) et 133 μL de FeCl₃ (30 mM dans HCl 1,2 M). Le mélange a été incubé à 37 °C à l'obscurité pendant 30 min. Après centrifugation à 10 000 g pendant 10 min, l'absorbance du surnageant a été mesurée à 670 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, États-Unis). Les concentrations en sulfure ont été déterminées à partir d'une courbe d'étalonnage de NaHS (0–100 μM) dans de l'eau distillée (figure supplémentaire 2). Toutes les solutions utilisées pour les mesures ont été préparées extemporanément. Les coefficients de variation intra- et inter-essais pour les mesures de sulfure étaient respectivement de 2,8 % et 3,4 %. Nous avons également déterminé la quantité totale de sulfure récupérée dans des échantillons d'eau potable et de sérum contenant du thiosulfate de sodium, en utilisant la méthode de l'échantillon enrichi⁴². Les taux de récupération pour les échantillons d'eau potable et de sérum contenant du thiosulfate de sodium étaient respectivement de 91 ± 1,1 % (n = 6) et de 93 ± 2,4 % (n = 6).
L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du logiciel GraphPad Prism version 8.0.2 pour Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, États-Unis, www.graphpad.com). Un test t de Student apparié a été utilisé pour comparer la température et le pH de l'eau de boisson avant et après l'ajout de NaHS. La perte de H₂S dans la solution contenant du NaHS a été calculée en pourcentage de diminution par rapport à l'absorption initiale. Afin d'évaluer la significativité statistique de cette perte, une ANOVA à mesures répétées à un facteur, suivie du test de comparaisons multiples de Dunnett, a été effectuée. Le poids corporel, l'urée sérique, la créatinine sérique et le sulfure sérique total ont été comparés au cours du temps entre les rats témoins et les rats traités au NaHS, de sexes différents, à l'aide d'une ANOVA mixte à deux facteurs (inter- et intra-sujets), suivie d'un test post-hoc de Bonferroni. Les valeurs de p bilatérales < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.
Le pH de l'eau potable était de 7,60 ± 0,01 avant l'ajout de NaHS et de 7,71 ± 0,03 après (n = 13, p = 0,0029). La température de l'eau potable était de 26,5 ± 0,2 °C et a diminué à 26,2 ± 0,2 °C après l'ajout de NaHS (n = 13, p = 0,0128). Une solution de NaHS à 30 μM a été préparée dans de l'eau potable et conservée dans une bouteille. Cette solution étant instable, sa concentration diminue avec le temps. Un prélèvement au niveau du goulot de la bouteille a révélé une diminution significative (68,0 %) dès la première heure, et la concentration de NaHS dans la solution a diminué de 72 % et 75 % après respectivement 12 et 24 heures. Dans les échantillons prélevés dans des bouteilles d'eau, la réduction de la concentration de NaHS n'était pas significative jusqu'à 2 heures, mais après 12 et 24 heures, elle avait diminué respectivement de 47 % et 72 %. Ces données indiquent que le pourcentage de NaHS dans une solution à 30 μM préparée dans de l'eau potable avait diminué d'environ un quart par rapport à sa valeur initiale après 24 heures, quel que soit le lieu de prélèvement (figure 1).
Stabilité d'une solution de NaHS (30 μM) dans l'eau de boisson de rats/souris. Après préparation de la solution, des échantillons ont été prélevés à l'extrémité et à l'intérieur du biberon. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type (n = 6/groupe). * et #, p < 0,05 par rapport au temps 0. La photographie du biberon montre l'extrémité (avec l'ouverture) et le corps du biberon. Le volume à l'extrémité est d'environ 740 μL.
La concentration de NaHS dans la solution fraîchement préparée à 30 μM était de 30,3 ± 0,4 μM (intervalle : 28,7–31,9 μM, n = 12). Cependant, après 24 h, la concentration de NaHS a diminué (moyenne : 3,0 ± 0,6 μM). Comme le montre la figure 2, les concentrations de NaHS auxquelles les rats ont été exposés n’étaient pas constantes au cours de l’étude.
Le poids corporel des rates a augmenté significativement au cours du temps (de 205,2 ± 5,2 g à 213,8 ​​± 7,0 g dans le groupe témoin et de 204,0 ± 8,6 g à 211,8 ± 7,5 g dans le groupe traité au NaHS) ; cependant, le traitement au NaHS n’a eu aucun effet sur le poids corporel (Fig. 3). Le poids corporel des rats mâles a également augmenté significativement au cours du temps (de 338,6 ± 8,3 g à 352,4 ± 6,0 g dans le groupe témoin et de 352,4 ± 5,9 g à 363,2 ± 4,3 g dans le groupe traité au NaHS) ; cependant, le traitement au NaHS n’a eu aucun effet sur le poids corporel (Fig. 3).
Évolution du poids corporel chez les rats mâles et femelles après administration de NaHS (30 μM). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard à la moyenne (SEM) et ont été comparées par une analyse de variance à deux facteurs (avec mesures répétées) suivie d'un test post-hoc de Bonferroni. n = 5 rats de chaque sexe dans chaque groupe.
Les concentrations sériques d'urée et de créatine phosphate étaient comparables chez les rats témoins et les rats traités au NaSH tout au long de l'étude. De plus, le traitement au NaSH n'a pas affecté les concentrations sériques d'urée et de créatinechrome (Tableau 1).
Les concentrations sériques initiales de sulfure total étaient comparables entre les rats mâles (8,1 ± 0,5 μM vs 9,3 ± 0,2 μM) et femelles (9,1 ± 1,0 μM vs 6,1 ± 1,1 μM) témoins et ceux traités au NaHS. L'administration de NaHS pendant 14 jours n'a eu aucun effet sur les concentrations sériques de sulfure total chez les rats mâles ou femelles (Fig. 4).
Évolution des concentrations sériques totales de sulfure chez les rats mâles et femelles après administration de NaHS (30 μM). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard à la moyenne (SEM) et ont été comparées par une analyse de variance à deux facteurs (avec mesures répétées) suivie d'un test post-hoc de Bonferroni. N = 5 par sexe et par groupe.
La principale conclusion de cette étude est que l'eau potable contenant du NaHS est instable : seul un quart environ de la teneur totale initiale en sulfure est détectable 24 heures après prélèvement à l'extrémité et à l'intérieur des biberons de rats/souris. De plus, les rats ont été exposés à des concentrations instables de NaHS en raison de la perte de H₂S dans la solution de NaHS, et l'ajout de NaHS à l'eau potable n'a eu aucun effet sur le poids corporel, l'urée et le chrome sériques, ni sur la teneur totale en sulfure sérique.
Dans cette étude, le taux de perte de H₂S à partir de solutions de NaHS à 30 μM préparées dans de l'eau potable était d'environ 3 % par heure. Dans une solution tamponnée (sulfure de sodium à 100 μM dans du PBS 10 mM, pH 7,4), la concentration en sulfure a diminué de 7 % sur une période de 8 h¹¹. Nous avons précédemment justifié l'administration intrapéritonéale de NaHS en rapportant que le taux de perte de sulfure à partir d'une solution de NaHS à 54 μM dans de l'eau potable était d'environ 2,3 % par heure (4 %/heure pendant les 12 premières heures et 1,4 %/heure pendant les 12 dernières heures après préparation)⁸. Des études antérieures⁴³ ont mis en évidence une perte constante de H₂S à partir de solutions de NaHS, principalement due à la volatilisation et à l'oxydation. Même sans ajout de bulles, le sulfure présent dans la solution mère disparaît rapidement par volatilisation de H₂S¹¹. Des études ont montré que lors de la dilution, qui dure environ 30 à 60 secondes, environ 5 à 10 % du H₂S s'évapore⁶. Pour limiter cette évaporation, les chercheurs ont mis en œuvre plusieurs mesures, notamment une agitation douce de la solution¹², le recouvrement de la solution mère par un film plastique⁶ et la réduction au minimum de son exposition à l'air, car la vitesse d'évaporation du H₂S dépend de l'interface air-liquide¹³. L'oxydation spontanée du H₂S est principalement due aux ions de métaux de transition, en particulier le fer ferrique, présents comme impuretés dans l'eau¹³. Cette oxydation conduit à la formation de polysulfures (atomes de soufre liés par des liaisons covalentes)¹¹. Pour éviter son oxydation, les solutions contenant du H₂S sont préparées dans des solvants désoxygénés⁴⁴,⁴⁵ puis purgées à l'argon ou à l'azote pendant 20 à 30 min afin d'assurer leur désoxygénation.¹¹,¹²,³⁷,⁴⁴,⁴⁵,⁴⁶ L'acide diéthylènetriaminepentaacétique (DTPA) est un chélateur de métaux (10⁻⁴ M) qui empêche l'auto-oxydation de HS⁻ en solution aérobie. En l'absence de DTPA, le taux d'auto-oxydation de HS⁻ est d'environ 50 % en 3 h à 25 °C³⁷,⁴⁷. De plus, l'oxydation du sulfure d'hydrogène étant catalysée par les ultraviolets, la solution doit être conservée sur glace et à l'abri de la lumière¹¹.
Comme illustré sur la figure 5, NaHS se dissocie en Na⁺ et HS⁻ lorsqu'il est dissous dans l'eau. Cette dissociation est déterminée par le pK₁ de la réaction, qui dépend de la température : pK₁ = 3,122 + 1132/T, où T varie de 5 à 30 °C et est exprimée en kelvins (K) : K = °C + 273,1548. HS⁻ possède un pK₂ élevé (pK₂ = 19), de sorte qu'à un pH inférieur à 96,49, S²⁻ ne se forme pas ou seulement en très faible quantité. En revanche, HS⁻ se comporte comme une base et accepte un proton (H⁺) d'une molécule d'eau (H₂O), tandis que H₂O se comporte comme un acide et est converti en H₂S et OH⁻.
Formation de sulfure d'hydrogène (H₂S) dissous dans une solution de NaHS (30 µM). aq : solution aqueuse ; g : gaz ; l : liquide. Tous les calculs supposent un pH de l'eau de 7,0 et une température de l'eau de 20 °C. Généré avec BioRender.com.
Malgré des preuves de l'instabilité des solutions de NaHS, plusieurs études animales ont utilisé des solutions de NaHS dans l'eau de boisson comme donneur de H₂S¹⁵,¹⁶,¹⁷,¹⁸,¹⁹,²⁰,²¹,²²,²³,²⁴,²⁵,²⁶, avec des durées d'intervention allant de 1 à 21 semaines (tableau 2). Au cours de ces études, la solution de NaHS était renouvelée toutes les 12, 15, 17, 18, 24, 25 h ou 24 h¹⁹, 20, 21, 22, 23 h. Nos résultats ont montré que les rats étaient exposés à des concentrations de NaHS instables en raison de la perte de H₂S de la solution, et que la concentration de NaHS dans leur eau de boisson fluctuait significativement sur 12 ou 24 h (voir figure 2). Deux de ces études ont rapporté que les concentrations de H₂S dans l'eau restaient stables pendant 24 h²² ou que seulement 2 à 3 % de pertes de H₂S étaient observées sur 12 h¹⁵, mais elles n'ont fourni aucune donnée ni précision quant aux mesures. Deux études ont montré que le faible diamètre des bouteilles d'eau pouvait minimiser l'évaporation du H₂S¹⁵,¹⁹. Cependant, nos résultats indiquent que cela ne retarde la perte de H₂S que de 2 h, et non de 12 à 24 h. Ces deux études précisent que nous supposons que la concentration de NaHS dans l'eau potable est restée stable, car nous n'avons observé aucun changement de couleur ; par conséquent, l'oxydation du H₂S par l'air était négligeable¹⁹,²⁰. De façon surprenante, cette méthode subjective évalue la stabilité du NaHS dans l'eau plutôt que de mesurer l'évolution de sa concentration au fil du temps.
La perte de H₂S dans une solution de NaHS est liée au pH et à la température. Comme indiqué dans notre étude, la dissolution de NaHS dans l'eau entraîne la formation d'une solution alcaline⁵⁰. Lors de la dissolution de NaHS dans l'eau, la formation de H₂S gazeux dépend du pH⁶. Plus le pH de la solution est bas, plus la proportion de NaHS présente sous forme de molécules de H₂S gazeux est importante et plus la perte de sulfure de la solution aqueuse est grande¹¹. Aucune de ces études n'a rapporté le pH de l'eau potable utilisée comme solvant pour le NaHS. Selon les recommandations de l'OMS, adoptées par la plupart des pays, le pH de l'eau potable devrait se situer entre 6,5 et 8,5⁵¹. Dans cette gamme de pH, le taux d'oxydation spontanée du H₂S est multiplié par dix environ¹³. La dissolution de NaHS dans l'eau à ce pH entraîne une concentration de H₂S gazeux dissous de 1 à 22,5 μM, ce qui souligne l'importance de contrôler le pH de l'eau avant la dissolution de NaHS. De plus, la plage de températures mentionnée dans l'étude susmentionnée (18–26 °C) entraînerait une variation d'environ 10 % de la concentration de H₂S dissous dans la solution, car les variations de température modifient le pK₁, et de faibles variations de pK₁ peuvent avoir un impact significatif sur la concentration de H₂S dissous⁴⁸. Par ailleurs, la longue durée de certaines études (5 mois)²², durant laquelle une forte variabilité de température est attendue, aggrave également ce problème.
Toutes les études, à l'exception d'une seule²¹, ont utilisé une solution de NaHS à 30 μM dans l'eau potable. Pour justifier cette dose (30 μM), certains auteurs ont souligné que le NaHS en phase aqueuse produit exactement la même concentration de H₂S gazeux et que la concentration physiologique de H₂S se situe entre 10 et 100 μM, cette dose étant donc dans l'intervalle physiologique^15,16. D'autres ont expliqué que 30 μM de NaHS permettent de maintenir le taux plasmatique de H₂S dans l'intervalle physiologique, soit entre 5 et 300 μM^19,20. Nous considérons ici une concentration de NaHS dans l'eau de 30 μM (pH = 7,0, T = 20 °C), concentration utilisée dans certaines études pour examiner les effets du H₂S. Nous calculons que la concentration de H₂S gazeux dissous est de 14,7 μM, soit environ 50 % de la concentration initiale de NaHS. Cette valeur est similaire à celle calculée par d'autres auteurs dans les mêmes conditions^13,48.
Dans notre étude, l'administration de NaHS n'a pas modifié le poids corporel ; ce résultat concorde avec ceux d'autres études menées chez des souris mâles^22,23 et des rats mâles¹⁸. Cependant, deux études ont rapporté que le NaHS rétablissait le poids corporel diminué chez des rats néphrectomisés^24,26, tandis que d'autres études n'ont pas rapporté d'effet de l'administration de NaHS sur le poids corporel^{15,16,17,19,20,21,25}. De plus, dans notre étude, l'administration de NaHS n'a pas affecté les taux sériques d'urée et de créatinine-chrome, ce qui concorde avec les résultats d'une autre étude²⁵.
L'étude a montré que l'ajout de NaHS à l'eau de boisson pendant deux semaines n'avait aucun effet sur les concentrations totales de sulfure sérique chez les rats mâles et femelles. Ce résultat concorde avec ceux de Sen et al. (16) : un traitement de huit semaines avec 30 µM de NaHS dans l'eau de boisson n'a pas modifié les taux de sulfure plasmatique chez les rats témoins ; toutefois, ces auteurs ont rapporté que cette intervention rétablissait les taux de H₂S plasmatiques diminués chez les souris néphrectomisées. Li et al. (22) ont également rapporté qu'un traitement de cinq mois avec 30 µM de NaHS dans l'eau de boisson augmentait les taux de sulfure libre plasmatique d'environ 26 % chez les souris âgées. D'autres études n'ont pas mis en évidence de modifications du sulfure circulant après l'ajout de NaHS à l'eau de boisson.
Sept études ont rapporté l'utilisation de NaHS de marque Sigma^{15,16,19,20,21,22,23}, mais sans fournir de détails supplémentaires sur l'eau d'hydratation. Cinq études n'ont pas mentionné la source de NaHS utilisée dans leurs méthodes de préparation^{17,18,24,25,26}. Le NaHS étant une molécule hydratée, sa teneur en eau d'hydratation peut varier, ce qui influe sur la quantité de NaHS nécessaire à la préparation d'une solution de molarité donnée. Par exemple, dans notre étude, le NaHS utilisé était de NaHS•1,3 H₂O. Par conséquent, les concentrations réelles de NaHS dans ces études peuvent être inférieures à celles rapportées.
« Comment un composé aussi éphémère peut-il avoir un effet aussi durable ? » C’est la question que se sont posée Pozgay et al.²¹ lors de l’évaluation des effets du NaHS sur la colite chez la souris. Ils espèrent que de futures études permettront d’y répondre et supposent que les solutions de NaHS pourraient contenir des polysulfures plus stables, en plus du H₂S et des disulfures qui sont responsables de l’effet du NaHS²¹. Une autre possibilité est que de très faibles concentrations de NaHS restant en solution puissent également avoir un effet bénéfique. En effet, Olson et al. ont démontré que des concentrations micromolaires de H₂S dans le sang ne sont pas physiologiques et devraient se situer dans la gamme nanomolaire, voire être totalement absentes¹³. Le H₂S pourrait agir par sulfatation des protéines, une modification post-traductionnelle réversible qui affecte la fonction, la stabilité et la localisation de nombreuses protéines^52,53,54. De fait, dans des conditions physiologiques, environ 10 à 25 % des protéines hépatiques sont sulfylées⁵³. Les deux études reconnaissent la destruction rapide du NaHS^19,23, mais affirment de façon surprenante : « Nous avons contrôlé la concentration de NaHS dans l’eau potable en la remplaçant quotidiennement. »²³ Une étude a même déclaré par erreur que « le NaHS est un donneur standard de H₂S et est couramment utilisé en pratique clinique pour remplacer le H₂S lui-même. »¹⁸
La discussion précédente montre que le NaHS s'évapore par volatilisation, oxydation et photolyse. Par conséquent, plusieurs suggestions sont formulées pour réduire les pertes de H₂S en solution. Premièrement, l'évaporation du H₂S dépend de l'interface gaz-liquide¹³ et du pH de la solution¹¹. Ainsi, pour minimiser les pertes par évaporation, le goulot de la bouteille d'eau peut être réduit au minimum, comme décrit précédemment¹⁵,¹⁹, et le pH de l'eau peut être ajusté à une limite supérieure acceptable (par exemple, 6,5–8,5⁵)¹¹. Deuxièmement, l'oxydation spontanée du H₂S se produit sous l'effet de l'oxygène et de la présence d'ions de métaux de transition dans l'eau potable¹³. La désoxygénation de l'eau potable à l'argon ou à l'azote⁴⁴,⁴⁵ et l'utilisation de chélateurs de métaux³⁷,⁴⁷ peuvent donc réduire l'oxydation des sulfures. Troisièmement, pour prévenir la photodécomposition du H₂S, les bouteilles d'eau peuvent être enveloppées de papier aluminium. Cette pratique s'applique également aux substances photosensibles telles que la streptozotocine⁵⁵. Enfin, les sulfures inorganiques (NaHS, Na₂S et CaS) peuvent être administrés par gavage plutôt que dissous dans l'eau de boisson, comme cela a été rapporté précédemment^56,57,58 ; des études ont montré que le sulfure de sodium radioactif administré par gavage chez le rat est bien absorbé et distribué dans la quasi-totalité des tissus⁵⁹. À ce jour, la plupart des études ont administré les sulfures inorganiques par voie intrapéritonéale ; cependant, cette voie est rarement utilisée en pratique clinique⁶⁰. En revanche, la voie orale est la voie d'administration la plus courante et la plus privilégiée chez l'humain⁶¹. Par conséquent, nous recommandons d'évaluer les effets des donneurs de H₂S chez les rongeurs par gavage oral.
Une limitation de notre étude réside dans l'utilisation de la méthode au bleu de méthylène (MB) pour le dosage des sulfures en solution aqueuse et dans le sérum. Parmi les méthodes de dosage des sulfures, on peut citer le titrage à l'iode, la spectrophotométrie, les méthodes électrochimiques (potentiométrie, ampérométrie, coulométrie et ampérométrie) et la chromatographie (chromatographie en phase gazeuse et chromatographie liquide à haute performance). La méthode spectrophotométrique au MB est la plus couramment employée⁶². L'une des limitations de cette méthode pour le dosage du H₂S dans les échantillons biologiques est qu'elle mesure tous les composés soufrés et non le H₂S libre⁶³, car elle est réalisée en milieu acide, ce qui entraîne l'extraction du soufre de la source biologique⁶⁴. Cependant, selon l'American Public Health Association, la méthode au MB est la méthode de référence pour le dosage des sulfures dans l'eau⁶⁵. Par conséquent, cette limitation n'affecte pas nos principaux résultats concernant l'instabilité des solutions contenant du NaHS. De plus, dans notre étude, les taux de récupération des mesures de sulfures dans les échantillons d'eau et de sérum contenant du NaHS étaient respectivement de 91 % et 93 %. Ces valeurs sont conformes aux intervalles précédemment rapportés (77–92)66, ce qui indique une précision analytique acceptable42. Il convient de noter que nous avons utilisé des rats mâles et femelles conformément aux directives des National Institutes of Health (NIH) afin d'éviter une dépendance excessive aux études précliniques sur des animaux mâles seulement67 et d'inclure des rats mâles et femelles chaque fois que cela était possible68. Ce point a été souligné par d'autres auteurs69,70,71.
En conclusion, les résultats de cette étude indiquent que les solutions de NaHS préparées à partir d'eau potable ne peuvent être utilisées pour générer du H₂S en raison de leur instabilité. Cette voie d'administration exposerait les animaux à des concentrations de NaHS instables et inférieures aux concentrations attendues ; par conséquent, les résultats pourraient ne pas être transposables à l'homme.
Les jeux de données utilisés et/ou analysés au cours de la présente étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.
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