Nous avons précédemment montré que les taux sériques de l'acide indole-3-propionique (IPA), un métabolite du tryptophane d'origine intestinale, sont plus faibles chez les patients atteints de fibrose hépatique. Dans cette étude, nous avons analysé le transcriptome et le méthylome de l'ADN dans des foies de sujets obèses en fonction des taux sériques d'IPA, ainsi que le rôle de l'IPA dans l'induction de l'inactivation phénotypique des cellules stellaires hépatiques (CSH) in vitro.
L’étude a inclus 116 patients obèses sans diabète de type 2 (âge : 46,8 ± 9,3 ans ; IMC : 42,7 ± 5,0 kg/m²) ayant subi une chirurgie bariatrique au Centre de chirurgie bariatrique de Kuopio (KOBS). Les concentrations circulantes d’IPA ont été mesurées par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS), l’analyse du transcriptome hépatique a été réalisée par séquençage de l’ARN total et l’analyse de la méthylation de l’ADN a été effectuée à l’aide de la puce Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Des cellules stellaires hépatiques humaines (LX-2) ont été utilisées pour les expériences in vitro.
Les concentrations sériques d'IPA étaient corrélées à l'expression de gènes impliqués dans les voies d'apoptose, de mitophagie et de longévité hépatiques. Le gène de la sérine/thréonine kinase 1 (AKT1) était le gène le plus abondant et le plus fortement impliqué dans les profils de transcription et de méthylation de l'ADN hépatiques. Le traitement par IPA induisait l'apoptose, diminuait la respiration mitochondriale et modifiait la morphologie cellulaire et la dynamique mitochondriale en modulant l'expression de gènes connus pour réguler la fibrose, l'apoptose et la survie des cellules LX-2.
Prises ensemble, ces données suggèrent que l'IPA possède des effets thérapeutiques potentiels et peut induire l'apoptose et faire basculer le phénotype des cellules souches hépatiques vers un état inactif, élargissant ainsi la possibilité d'inhiber la fibrose hépatique en interférant avec l'activation des cellules souches hépatiques et le métabolisme mitochondrial.
La prévalence de l'obésité et du syndrome métabolique est associée à une incidence croissante de stéatose hépatique métabolique (SHHM) ; cette maladie touche 25 à 30 % de la population générale [1]. La principale conséquence de l'étiologie de la SHHM est la fibrose hépatique, un processus dynamique caractérisé par une accumulation continue de matrice extracellulaire (MEC) fibreuse [2]. Les principales cellules impliquées dans la fibrose hépatique sont les cellules stellaires hépatiques (CSH), qui présentent quatre phénotypes connus : quiescent, activé, inactivé et sénescent [3, 4]. Les CSH peuvent être activées et se transdifférencier d'une forme quiescente en cellules prolifératives de type fibroblastique, à forte demande énergétique, avec une expression accrue d'actine musculaire lisse α (α-SMA) et de collagène de type I (Col-I) [5, 6]. Lors de la régression de la fibrose hépatique, les CSH activées sont éliminées par apoptose ou inactivation. Ces processus comprennent la régulation négative des gènes fibrogéniques et la modulation des gènes prosurvie (tels que les voies de signalisation NF-κB et PI3K/Akt) [7, 8], ainsi que des changements dans la dynamique et la fonction mitochondriales [9].
Les taux sériques de l'acide indole-3-propionique (IPA), un métabolite du tryptophane produit dans l'intestin, sont diminués dans les maladies métaboliques humaines, notamment la stéatohépatite non alcoolique (SHANA) [10-13]. L'IPA est associé à l'apport en fibres alimentaires, est reconnu pour ses effets antioxydants et anti-inflammatoires, et atténue le phénotype de la stéatohépatite non alcoolique (NASH) induite par l'alimentation, in vivo et in vitro [11-14]. Notre étude précédente, menée dans le cadre de l'étude KOBS (Kuopio Bariatric Surgery Study), a démontré que les taux sériques d'IPA étaient plus faibles chez les patients atteints de fibrose hépatique que chez les patients obèses sans fibrose hépatique. De plus, nous avons montré que le traitement par IPA pouvait réduire l'expression de gènes marqueurs classiques de l'adhésion cellulaire, de la migration cellulaire et de l'activation des cellules souches hématopoïétiques dans un modèle de cellules stellaires hépatiques humaines (LX-2), et qu'il s'agit d'un métabolite hépatoprotecteur potentiel [15]. Cependant, on ignore encore comment l'IPA induit la régression de la fibrose hépatique en activant l'apoptose des cellules HSC et la bioénergétique mitochondriale.
Dans cette étude, nous démontrons que l'IPA sérique est associée à l'expression de gènes impliqués dans l'apoptose, la mitophagie et les voies de longévité dans le foie de sujets obèses non diabétiques de type 2 (KOBS). De plus, nous avons constaté que l'IPA peut induire l'élimination et la dégradation des cellules souches hématopoïétiques (CSH) activées via la voie d'inactivation. Ces résultats révèlent un rôle inédit de l'IPA, faisant de cette molécule une cible thérapeutique potentielle pour favoriser la régression de la fibrose hépatique.
Une étude antérieure menée au sein de la cohorte KOBS a montré que les patients atteints de fibrose hépatique présentaient des taux d'IPA circulants plus faibles que les patients sans fibrose hépatique [15]. Afin d'exclure tout effet confondant potentiel du diabète de type 2, nous avons recruté 116 patients obèses non diabétiques (âge moyen ± écart-type : 46,8 ± 9,3 ans ; IMC : 42,7 ± 5,0 kg/m²) (tableau 1) parmi les participants à l'étude KOBS en cours [16]. Tous les participants ont donné leur consentement éclairé par écrit et le protocole de l'étude a été approuvé par le Comité d'éthique de l'hôpital du comté de Savo-Nord, conformément à la Déclaration d'Helsinki (54/2005, 104/2008 et 27/2010).
Des biopsies hépatiques ont été réalisées lors de chirurgies bariatriques et analysées histologiquement par des pathologistes expérimentés selon des critères précédemment décrits [17, 18]. Ces critères d’évaluation sont résumés dans le tableau supplémentaire S1 et ont été décrits précédemment [19].
Des échantillons de sérum prélevés à jeun ont été analysés par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) non ciblée pour une analyse métabolomique (n = 116). Les échantillons ont été analysés à l'aide d'un système UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Allemagne) comme décrit précédemment¹⁹. L'identification de l'alcool isopropylique (IPA) a été réalisée par détermination du temps de rétention et comparaison du spectre MS/MS avec des standards purs. L'intensité du signal de l'IPA (aire du pic) a été prise en compte dans toutes les analyses ultérieures [20].
Le séquençage de l'ARN du foie entier a été réalisé à l'aide d'un séquenceur Illumina HiSeq 2500 et les données ont été prétraitées comme décrit précédemment [19, 21, 22]. Nous avons effectué une analyse d'expression différentielle ciblée des transcrits impliqués dans la fonction/biogenèse mitochondriale à partir de 1957 gènes sélectionnés dans la base de données MitoMiner 4.0 [23]. L'analyse de la méthylation de l'ADN hépatique a été réalisée à l'aide de la puce Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, États-Unis) selon la méthodologie décrite précédemment [24, 25].
Les cellules stellaires hépatiques humaines (LX-2) ont été aimablement fournies par le Pr Stefano Romeo et cultivées dans du milieu DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1 % de pénicilline/streptomycine ; Lonza, DE17-602E, 2 % de sérum fœtal bovin ; Gibco, 10270-106). Afin de déterminer la dose efficace d'IPA, les cellules LX-2 ont été traitées avec différentes concentrations d'IPA (10 μM, 100 μM et 1 mM ; Sigma, 220027) dans du milieu DMEM/F12 pendant 24 h. De plus, pour étudier la capacité de l'IPA à inactiver les cellules stellaires hépatiques, les cellules LX-2 ont été traitées simultanément avec 5 ng/ml de TGF-β1 (R&D Systems, 240-B-002/CF) et 1 mM d'IPA dans un milieu sans sérum pendant 24 h. Pour les témoins de véhicule correspondants, 4 nM de HCL contenant 0,1 % de BSA ont été utilisés pour le traitement au TGF-β1 et 0,05 % de DMSO ont été utilisés pour le traitement à l'IPA, et les deux ont été utilisés ensemble pour le traitement combiné.
L'apoptose a été évaluée à l'aide du kit de détection d'apoptose FITC-annexine V avec 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, États-Unis, réf. 640922), conformément aux instructions du fabricant. Brièvement, les cellules LX-2 (1 × 10⁵ cellules/puits) ont été cultivées pendant une nuit dans des plaques 12 puits, puis traitées avec différentes doses d'IPA ou d'IPA et de TGF-β1. Le lendemain, les cellules en suspension et adhérentes ont été collectées, trypsinées, lavées avec du PBS, remises en suspension dans un tampon de liaison à l'annexine V et incubées avec l'annexine V-FITC et le 7-AAD pendant 15 minutes.
L'activité oxydative des mitochondries de cellules vivantes a été visualisée par coloration au Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Pour les dosages MTR, les cellules LX-2 ont été incubées à densité égale avec de l'IPA et du TGF-β1. Après 24 h, les cellules vivantes ont été trypsinées, lavées au PBS, puis incubées avec 100 μM de MTR dans un milieu sans sérum à 37 °C pendant 20 min, comme décrit précédemment [26]. Pour l'analyse morphologique des cellules vivantes, la taille cellulaire et la complexité cytoplasmique ont été analysées respectivement par diffusion avant (FSC) et diffusion latérale (SSC).
Toutes les données (30 000 événements) ont été acquises à l'aide de NovoCyte Quanteon (Agilent) et analysées à l'aide du logiciel NovoExpress® 1.4.1 ou FlowJo V.10.
Le taux de consommation d'oxygène (OCR) et le taux d'acidification extracellulaire (ECAR) ont été mesurés en temps réel à l'aide d'un analyseur de flux extracellulaire Seahorse (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) équipé d'un module Seahorse XF Cell Mito Stress, conformément aux instructions du fabricant. Brièvement, 2 × 10⁴ cellules LX-2 par puits ont été ensemencées dans des plaques de culture cellulaire XF96. Après une incubation d'une nuit, les cellules ont été traitées avec de l'isopropanol (IPA) et du TGF-β1 (voir Méthodes supplémentaires 1). L'analyse des données a été réalisée à l'aide du logiciel Seahorse XF Wave, qui inclut le générateur de rapports de test du phénotype énergétique cellulaire Seahorse XF. Un indice de santé bioénergétique (BHI) a ainsi été calculé [27].
L'ARN total a été transcrit en ADNc. Pour plus de détails sur la méthode, voir la référence [15]. Les niveaux d'ARNm de la protéine ribosomique acide 60S P0 (RPLP0) et de la cyclophiline A1 (PPIA) humaines ont servi de contrôles d'expression constitutifs. Le système de PCR en temps réel QuantStudio 6 pro (Thermo Fisher, Landsmeer, Pays-Bas) a été utilisé avec le kit TaqMan™ Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) ou le kit Sensifast SYBR Lo-ROX (Bioline, BIO 94050). L'expression génique relative a été calculée à l'aide des paramètres de cyclage comparatifs des valeurs Ct (ΔΔCt) et de la méthode ∆∆Ct. Les détails des amorces sont fournis dans les tableaux supplémentaires S2 et S3.
L’ADN nucléaire (ADNnc) et l’ADN mitochondrial (ADNmt) ont été extraits à l’aide du kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen), comme décrit précédemment [28]. La quantité relative d’ADNmt a été calculée en déterminant le rapport de chaque région cible d’ADNmt à la moyenne géométrique des trois régions d’ADN nucléaire (ADNmt/ADNnc), comme détaillé dans les méthodes supplémentaires 2. Les détails des amorces pour l’ADNmt et l’ADNnc sont fournis dans le tableau supplémentaire S4.
Les cellules vivantes ont été colorées avec le Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) afin de visualiser les réseaux mitochondriaux intercellulaires et intracellulaires. Les cellules LX-2 (1 × 10⁴ cellules/puits) ont été cultivées sur des lames de verre dans des plaques de culture à fond de verre (Ibidi GmbH, Martinsried, Allemagne). Après 24 h, les cellules LX-2 vivantes ont été incubées avec 100 μM de MTR pendant 20 min à 37 °C, puis les noyaux cellulaires ont été colorés avec du DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) selon le protocole décrit précédemment [29]. Les réseaux mitochondriaux ont été visualisés à l'aide d'un microscope inversé Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Iéna, Allemagne) équipé d'un module confocal Zeiss LSM 800, à 37 °C sous atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂, avec un objectif 63× NA 1,3. Dix séries d'images en coupe Z ont été acquises pour chaque type d'échantillon. Chaque série Z comprend 30 coupes d'une épaisseur de 9,86 μm. Pour chaque échantillon, les images de dix champs de vision différents ont été acquises à l'aide du logiciel ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Iéna, Allemagne), et l'analyse morphologique des mitochondries a été réalisée avec le logiciel ImageJ (v1.54d) [30, 31] selon les paramètres détaillés dans les méthodes supplémentaires 3.
Les cellules ont été fixées avec du glutaraldéhyde à 2 % dans un tampon phosphate 0,1 M, puis avec une solution de tétroxyde d'osmium à 1 % (Sigma Aldrich, MO, États-Unis), déshydratées progressivement à l'acétone (Merck, Darmstadt, Allemagne) et enfin incluses dans une résine époxy. Des coupes ultrafines ont été réalisées et colorées à l'acétate d'uranyle à 1 % (Merck, Darmstadt, Allemagne) et au citrate de plomb à 1 % (Merck, Darmstadt, Allemagne). Les images ultrastructurales ont été obtenues à l'aide d'un microscope électronique à transmission JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokyo, Japon) sous une tension d'accélération de 80 kV.
La morphologie des cellules LX-2 traitées à l'IPA pendant 24 h a été analysée par microscopie à contraste de phase à un grossissement de 50x à l'aide d'un microscope optique inversé Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 et AxioCam MRm, Jena, Allemagne).
Les données cliniques ont été exprimées sous forme de moyenne ± écart-type ou de médiane (intervalle interquartile : IQR). Une analyse de variance à un facteur (variables continues) ou un test du χ² (variables catégorielles) ont été utilisés pour comparer les différences entre les trois groupes étudiés. Le taux de faux positifs (FDR) a été utilisé pour corriger les tests multiples, et les gènes présentant un FDR < 0,05 ont été considérés comme statistiquement significatifs. Une analyse de corrélation de Spearman a été utilisée pour corréler la méthylation de l’ADN CpG avec l’intensité du signal IPA, les valeurs p nominales (p < 0,05) étant rapportées.
L'analyse des voies métaboliques a été réalisée à l'aide de l'outil d'analyse de gènes en ligne WebGestalt pour 268 transcrits (p nominal < 0,01), 119 transcrits associés aux mitochondries (p nominal < 0,05) et 4 350 sites CpG parmi 3 093 transcrits hépatiques associés aux taux sériques d'IPA circulants. L'outil gratuit VennyDB (version 2.1.0) a été utilisé pour identifier les gènes communs, et StringDB (version 11.5) pour visualiser les interactions protéine-protéine.
Pour l'expérience LX-2, la normalité des échantillons a été vérifiée par le test de D'Agostino-Pearson. Les données, issues d'au moins trois réplicats biologiques, ont été analysées par une ANOVA à un facteur, suivie d'un test post-hoc de Bonferroni. Un seuil de signification de p < 0,05 a été retenu. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type, et le nombre d'expériences est indiqué sur chaque figure. Toutes les analyses et tous les graphiques ont été réalisés avec le logiciel statistique GraphPad Prism 8 pour Windows (GraphPad Software Inc., version 8.4.3, San Diego, États-Unis).
Nous avons d'abord étudié l'association entre les taux sériques d'IPA et les transcrits hépatiques, systémiques et mitochondriaux. Dans le profil de transcription total, le gène le plus fortement associé aux taux sériques d'IPA était MAPKAPK3 (FDR = 0,0077 ; protéine kinase 3 activée par la mitogène-activated protein kinase) ; dans le profil de transcription mitochondrial, le gène le plus fortement associé était AKT1 (FDR = 0,7621 ; AKT sérine/thréonine kinase 1) (Fichiers supplémentaires 1 et 2).
Nous avons ensuite analysé les transcrits globaux (n = 268 ; p < 0,01) et les transcrits associés aux mitochondries (n = 119 ; p < 0,05), identifiant finalement l’apoptose comme la voie canonique la plus significative (p = 0,0089). Concernant les transcrits mitochondriaux associés aux taux sériques d’IPA, nous nous sommes concentrés sur les voies de signalisation de l’apoptose (FDR = 0,00001), de la mitophagie (FDR = 0,00029) et du TNF (FDR = 0,000006) (Figure 1A, Tableau 2 et Figures supplémentaires 1A-B).
Analyse comparative des transcrits globaux, des transcrits associés aux mitochondries et de la méthylation de l'ADN dans le foie humain, en lien avec les taux sériques d'IPA. La figure A représente 268 transcrits globaux, 119 transcrits associés aux mitochondries et des transcrits méthylés, cartographiés sur 3 092 sites CpG associés aux taux sériques d'IPA (p < 0,01 pour les transcrits globaux et les transcrits méthylés, et p < 0,05 pour les transcrits mitochondriaux). Les principaux transcrits communs sont indiqués au centre (AKT1 et YKT6). La figure B présente la carte d'interaction des 13 gènes présentant le score d'interaction le plus élevé (0,900) avec d'autres gènes. Cette carte a été construite à partir des 56 gènes communs (zone délimitée par un trait noir) significativement associés aux taux sériques d'IPA, à l'aide de l'outil en ligne StringDB. En vert : gènes associés à la composante cellulaire mitochondriale de l'ontologie génique (GO) (GO :0005739). D'après les données (issues de l'exploration de textes, d'expériences, de bases de données et de co-expression), AKT1 est la protéine présentant le score le plus élevé (0,900) d'interactions avec d'autres protéines. Les nœuds du réseau représentent les protéines et les arêtes, les interactions entre elles.
Étant donné que les métabolites du microbiote intestinal peuvent réguler la composition épigénétique par méthylation de l'ADN [32], nous avons examiné si les taux sériques d'IPA étaient associés à la méthylation de l'ADN hépatique. Nous avons constaté que les deux principaux sites de méthylation associés aux taux sériques d'IPA se situaient à proximité de la région riche en proline-sérine 3 (C19orf55) et du gène HSPB6 (protéine de choc thermique de la famille B, petite protéine) (Fichier supplémentaire 3). La méthylation de l'ADN de 4 350 sites CpG (p < 0,01) était corrélée aux taux sériques d'IPA et était enrichie dans les voies de régulation de la longévité (p = 0,006) (Figure 1A, Tableau 2 et Figure supplémentaire 1C).
Afin de comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents aux associations entre les taux sériques d'IPA, les transcrits globaux, les transcrits associés aux mitochondries et la méthylation de l'ADN dans le foie humain, nous avons réalisé une analyse de chevauchement des gènes identifiés lors de l'analyse de voies métaboliques précédente (Figure 1A). Les résultats de l'analyse d'enrichissement des voies métaboliques des 56 gènes communs (encadrés en noir sur la Figure 1A) ont montré que la voie de l'apoptose (p = 0,00029) mettait en évidence deux gènes communs aux trois analyses : AKT1 et YKT6 (homologue de YKT6 v-SNARE), comme illustré dans le diagramme de Venn (Figure supplémentaire 2 et Figure 1A). De manière intéressante, nous avons constaté que les sites de transcription AKT1 (cg19831386) et YKT6 (cg24161647) étaient positivement corrélés aux taux sériques d'IPA (Fichier supplémentaire 3). Afin d'identifier les interactions protéiques potentielles entre les produits des gènes, nous avons sélectionné 13 gènes présentant le score de région commune le plus élevé (0,900) parmi 56 gènes chevauchants et construit une carte d'interactions. Selon le niveau de confiance (confiance marginale), le gène AKT1, avec le score le plus élevé (0,900), figurait en tête de liste (Figure 1B).
L’analyse des voies de signalisation a révélé que l’apoptose était la voie principale. Nous avons donc étudié l’effet d’un traitement à l’IPA sur l’apoptose des cellules HSC in vitro. Nous avons précédemment démontré que différentes doses d’IPA (10 μM, 100 μM et 1 mM) étaient non toxiques pour les cellules LX-2 [15]. Cette étude a montré qu’un traitement à l’IPA à 10 μM et 100 μM augmentait le nombre de cellules viables et nécrotiques. Cependant, comparativement au groupe témoin, la viabilité cellulaire diminuait à une concentration d’IPA de 1 mM, tandis que le taux de nécrose cellulaire restait inchangé (figures 2A et 2B). Afin de déterminer la concentration optimale pour induire l’apoptose dans les cellules LX-2, nous avons testé des concentrations d’IPA de 10 μM, 100 μM et 1 mM pendant 24 h (figures 2A à 2E et figures supplémentaires 3A et 3B). Il est intéressant de noter que l'IPA à 10 μM et 100 μM a diminué le taux d'apoptose (%), cependant, l'IPA à 1 mM a augmenté l'apoptose tardive et le taux d'apoptose (%) par rapport au contrôle et a donc été choisi pour des expériences ultérieures (Figures 2A–D).
L'IPA induit l'apoptose des cellules LX-2. La méthode de double marquage à l'annexine V et au 7-AAD a été utilisée pour quantifier le taux d'apoptose et la morphologie cellulaire par cytométrie en flux. Les cellules BA ont été incubées avec 10 μM, 100 μM et 1 mM d'IPA pendant 24 h ou avec du TGF-β1 F-H (5 ng/ml) et 1 mM d'IPA dans un milieu sans sérum pendant 24 h. A : cellules vivantes (annexine V -/ 7-AAD -) ; B : cellules nécrotiques (annexine V -/ 7-AAD +) ; C, F : apoptose précoce (annexine V +/ 7-AAD -) ; D, G : apoptose tardive (annexine V +/7-AAD +) ; E, H : pourcentage de cellules en apoptose précoce et tardive (taux d'apoptose). Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± écart-type, n = 3 expériences indépendantes. Les comparaisons statistiques ont été réalisées par une analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie d'un test post-hoc de Bonferroni. *p < 0,05 ; ****p < 0,0001
Comme nous l'avons montré précédemment, le TGF-β1 (5 ng/ml) peut induire l'activation des cellules souches hématopoïétiques (CSH) en augmentant l'expression de gènes marqueurs classiques [15]. Les cellules LX-2 ont été traitées simultanément avec 5 ng/ml de TGF-β1 et 1 mM d'IPA (Fig. 2E–H). Le traitement par TGF-β1 seul n'a pas modifié le taux d'apoptose. En revanche, le traitement concomitant par IPA a augmenté l'apoptose tardive et le taux d'apoptose (%) par rapport au traitement par TGF-β1 seul (Fig. 2E–H). Ces résultats indiquent que l'IPA (1 mM) peut induire l'apoptose des cellules LX-2 indépendamment de l'induction par le TGF-β1.
Nous avons ensuite étudié l'effet de l'IPA sur la respiration mitochondriale dans les cellules LX-2. Les résultats ont montré qu'une concentration de 1 mM d'IPA diminuait les paramètres du taux de consommation d'oxygène (TCO) : respiration non mitochondriale, respiration basale et maximale, fuite de protons et production d'ATP, comparativement au groupe témoin (figures 3A et 3B), tandis que l'indice de santé bioénergétique (ISB) restait inchangé.
L'IPA réduit la respiration mitochondriale dans les cellules LX-2. La courbe de respiration mitochondriale (CRM) est présentée sous forme de paramètres de respiration mitochondriale (respiration non mitochondriale, respiration basale, respiration maximale, fuite de protons, production d'ATP, SRC et BHI). Les cellules A et B ont été incubées avec respectivement 10 μM, 100 μM et 1 mM d'IPA pendant 24 h. Les cellules C et D ont été incubées respectivement avec du TGF-β1 (5 ng/ml) et 1 mM d'IPA dans un milieu sans sérum pendant 24 h. Toutes les mesures ont été normalisées par rapport à la teneur en ADN à l'aide du kit CyQuant. BHI : indice de santé bioénergétique ; SRC : capacité de réserve respiratoire ; CRM : taux de consommation d'oxygène. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type (ET), n = 5 expériences indépendantes. Les comparaisons statistiques ont été réalisées par ANOVA à un facteur et test post-hoc de Bonferroni. *p < 0,05. **p < 0,01 ; et ***p < 0,001
Afin de mieux comprendre l'effet de l'IPA sur le profil bioénergétique des cellules LX-2 activées par le TGF-β1, nous avons analysé la phosphorylation oxydative mitochondriale par OCR (Fig. 3C,D). Les résultats ont montré que le traitement au TGF-β1 réduisait la respiration maximale, la capacité de réserve respiratoire (SRC) et l'indice de métabolisme basal (BHI) par rapport au groupe témoin (Fig. 3C,D). De plus, le traitement combiné diminuait la respiration basale, la fuite de protons et la production d'ATP, mais la SRC et le BHI étaient significativement plus élevés que ceux des cellules traitées au TGF-β1 seul (Fig. 3C,D).
Nous avons également réalisé le test de phénotype énergétique cellulaire fourni par le logiciel Seahorse (Fig. S4A–D). Comme illustré dans la Fig. S3B, les potentiels métaboliques OCR et ECAR ont diminué après le traitement au TGF-β1. Cependant, aucune différence n'a été observée entre le groupe traité par la thérapie combinée et le groupe traité par l'IPA et le groupe témoin. De plus, les niveaux basaux et de stress de l'OCR ont diminué après les traitements combiné et par l'IPA par rapport au groupe témoin (Fig. S4C). Fait intéressant, un profil similaire a été observé avec la thérapie combinée, où aucune modification des niveaux basaux et de stress de l'ECAR n'a été observée par rapport au traitement au TGF-β1 (Fig. S4C). Dans les HSC, la réduction de la phosphorylation oxydative mitochondriale et la capacité du traitement combiné à restaurer le SCR et le BHI après exposition au TGF-β1 n'ont pas altéré le potentiel métabolique (OCR et ECAR). Pris ensemble, ces résultats indiquent que l'IPA peut réduire la bioénergétique dans les HSC, suggérant que l'IPA peut induire un profil énergétique inférieur qui déplace le phénotype des HSC vers l'inactivation (Figure supplémentaire 4D).
L'effet de l'IPA sur la dynamique mitochondriale a été étudié par quantification tridimensionnelle de la morphologie mitochondriale et des connexions du réseau, ainsi que par coloration MTR (Figure 4 et Figure supplémentaire 5). La Figure 4 montre que, comparativement au groupe témoin, le traitement au TGF-β1 a diminué la surface moyenne, le nombre de ramifications, la longueur totale des ramifications et le nombre de jonctions entre les ramifications (Figure 4A et B), et a modifié la proportion de mitochondries, passant d'une morphologie sphérique à une morphologie intermédiaire (Figure 4C). Seul le traitement à l'IPA a diminué le volume mitochondrial moyen et modifié la proportion de mitochondries, passant d'une morphologie sphérique à une morphologie intermédiaire, comparativement au groupe témoin (Figure 4A). En revanche, la sphéricité, la longueur moyenne des ramifications et l'activité mitochondriale, évaluée par MTR dépendant du potentiel de membrane mitochondrial (Figure 4A et E), sont restées inchangées et ces paramètres n'ont pas différé entre les groupes. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que le traitement par TGF-β1 et IPA semble moduler la forme et la taille des mitochondries ainsi que la complexité du réseau dans les cellules LX-2 vivantes.
L'IPA modifie la dynamique mitochondriale et l'abondance de l'ADN mitochondrial dans les cellules LX-2. A. Images confocales représentatives de cellules LX-2 vivantes incubées avec du TGF-β1 (5 ng/ml) et 1 mM d'IPA pendant 24 h en milieu sans sérum, montrant les réseaux mitochondriaux marqués au Mitotracker™ Red CMXRos et les noyaux marqués en bleu au DAPI. Chaque groupe comprenait au moins 15 images. Dix acquisitions en Z ont été réalisées pour chaque type d'échantillon. Chaque séquence selon l'axe Z comportait 30 coupes de 9,86 μm d'épaisseur. Échelle : 10 μm. B. Objets représentatifs (mitochondries uniquement) identifiés par seuillage adaptatif. Une analyse quantitative et une comparaison des connexions du réseau morphologique mitochondrial ont été effectuées pour toutes les cellules de chaque groupe. C. Fréquence des rapports de forme des mitochondries. Les valeurs proches de 0 indiquent des formes sphériques, et les valeurs proches de 1 des formes filamenteuses. D. La teneur en ADN mitochondrial (ADNmt) a été déterminée comme décrit dans la section Matériels et méthodes. E. L'analyse Mitotracker™ Red CMXRos a été réalisée par cytométrie en flux (30 000 événements) comme décrit dans la section Matériels et méthodes. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type, n = 3 expériences indépendantes. Les comparaisons statistiques ont été effectuées par ANOVA à un facteur et test post-hoc de Bonferroni. *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001 ; ****p < 0,0001
Nous avons ensuite analysé la teneur en ADNmt des cellules LX-2 comme indicateur du nombre de mitochondries. Comparée au groupe témoin, la teneur en ADNmt était augmentée dans le groupe traité au TGF-β1 (Figure 4D). Comparée au groupe traité au TGF-β1 seul, la teneur en ADNmt était diminuée dans le groupe soumis au traitement combiné (Figure 4D), suggérant que l'IPA pourrait réduire la teneur en ADNmt et possiblement le nombre de mitochondries ainsi que la respiration mitochondriale (Figure 3C). De plus, l'IPA semblait réduire la teneur en ADNmt dans le traitement combiné, mais n'affectait pas l'activité mitochondriale médiée par MTR (Figures 4A–C).
Nous avons étudié l'association de l'IPA avec les niveaux d'ARNm des gènes impliqués dans la fibrose, l'apoptose, la survie et la dynamique mitochondriale dans les cellules LX-2 (Figure 5A–D). Comparé au groupe témoin, le groupe traité au TGF-β1 a présenté une expression accrue de gènes tels que la chaîne α2 du collagène de type I (COL1A2), l'actine musculaire lisse α (αSMA), la métalloprotéinase matricielle 2 (MMP2), l'inhibiteur tissulaire des métalloprotéinases 1 (TIMP1) et le gène de type dynamine 1 (DRP1), indiquant une fibrose et une activation accrues. De plus, comparativement au groupe témoin, le traitement par TGF-β1 a réduit les niveaux d'ARNm du récepteur X de la prégnane nucléaire (PXR), de la caspase 8 (CASP8), de MAPKAPK3, de l'inhibiteur de la sous-unité α des lymphocytes B, du peptide léger de l'amplificateur du gène du facteur nucléaire κ (NFκB1A) et de la sous-unité β de la kinase du facteur nucléaire κB (IKBKB) (Figure 5A–D). Comparativement au traitement par TGF-β1 seul, le traitement combiné par TGF-β1 et IPA a réduit l'expression de COL1A2 et de MMP2, mais a augmenté les niveaux d'ARNm de PXR, TIMP1, du lymphome à cellules B-2 (BCL-2), de CASP8, de NFκB1A, de NFκB1-β et d'IKBKB. Le traitement par IPA a significativement diminué l'expression de MMP2, de BAX, d'AKT1, d'OPA1 et de MFN2, tandis que celle de CASP8, NFκB1A, NFκB1B et IKBKB a augmenté par rapport au groupe témoin. En revanche, aucune différence n'a été observée dans l'expression de CASP3, d'APAF1, de MFN1 et de FIS1. Ces résultats suggèrent que le traitement par IPA module l'expression des gènes impliqués dans la fibrose, l'apoptose, la survie cellulaire et la dynamique mitochondriale. Nos données indiquent que le traitement par IPA réduit la fibrose dans les cellules LX-2 et, simultanément, stimule leur survie en induisant une inactivation de ces gènes.
L'IPA module l'expression des gènes impliqués dans la différenciation des fibroblastes, l'apoptose, la viabilité cellulaire et la dynamique mitochondriale dans les cellules LX-2. Les histogrammes présentent l'expression des ARNm par rapport au contrôle endogène (RPLP0 ou PPIA) après induction des cellules LX-2 par le TGF-β1 et l'IPA en milieu sans sérum pendant 24 h. A représente les fibroblastes, B les cellules apoptotiques, C les cellules survivantes et D l'expression des gènes impliqués dans la dynamique mitochondriale. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type (ET), n = 3 expériences indépendantes. Les comparaisons statistiques ont été réalisées par ANOVA à un facteur et test post-hoc de Bonferroni. *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001 ; ****p < 0,0001
Ensuite, les variations de taille cellulaire (FSC-H) et de complexité cytoplasmique (SSC-H) ont été évaluées par cytométrie en flux (figures 6A et 6B), et les modifications de la morphologie cellulaire après traitement à l'IPA ont été évaluées par microscopie électronique à transmission (MET) et microscopie à contraste de phase (figures supplémentaires 6A et 6B). Conformément aux attentes, la taille des cellules du groupe traité au TGF-β1 a augmenté par rapport au groupe témoin (figures 6A et 6B), présentant l'expansion classique du réticulum endoplasmique rugueux (RE*) et des phagolysosomes (P), indiquant l'activation des cellules souches hématopoïétiques (CSH) (figure supplémentaire 6A). Cependant, comparativement au groupe traité au TGF-β1 seul, la taille cellulaire, la complexité cytoplasmique (figures 6A et 6B) et la quantité de RE* ont diminué dans le groupe traité par la combinaison TGF-β1 et IPA (figure supplémentaire 6A). De plus, le traitement à l'IPA a diminué la taille cellulaire, la complexité cytoplasmique (Fig. 6A, B) et les contenus en P et ER* (Fig. S6A) par rapport au groupe témoin. Par ailleurs, le nombre de cellules apoptotiques a augmenté après 24 h de traitement à l'IPA par rapport au groupe témoin (flèches blanches, Fig. S6B). L'ensemble de ces résultats suggère que l'IPA à 1 mM peut stimuler l'apoptose des cellules souches hématopoïétiques (CSH) et inverser les modifications des paramètres morphologiques cellulaires induites par le TGF-β1, régulant ainsi la taille et la complexité cellulaires, ce qui pourrait être associé à l'inactivation des CSH.
L'IPA modifie la taille et la complexité cytoplasmique des cellules LX-2. Images représentatives d'une analyse par cytométrie en flux. L'analyse a utilisé une stratégie de sélection spécifique aux cellules LX-2 : SSC-A/FSC-A pour définir la population cellulaire, FSC-H/FSC-A pour identifier les doublets et SSC-H/FSC-H pour l'analyse de la taille et de la complexité cellulaires. Les cellules ont été incubées avec du TGF-β1 (5 ng/ml) et 1 mM d'IPA dans un milieu sans sérum pendant 24 h. Les cellules LX-2 ont été réparties dans les quadrants suivants pour l'analyse de leur taille et de leur complexité cytoplasmique : quadrant inférieur gauche (SSC-H-/FSC-H-), quadrant supérieur gauche (SSC-H+/FSC-H-), quadrant inférieur droit (SSC-H-/FSC-H+) et quadrant supérieur droit (SSC-H+/FSC-H+). B. La morphologie cellulaire a été analysée par cytométrie en flux à l'aide des techniques FSC-H (diffusion avant, taille cellulaire) et SSC-H (diffusion latérale, complexité cytoplasmique) (30 000 événements). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type, n = 3 expériences indépendantes. Les comparaisons statistiques ont été réalisées par ANOVA à un facteur et test post-hoc de Bonferroni. *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001 et ****p < 0,0001.
Les métabolites intestinaux, tels que l'IPA, suscitent un vif intérêt dans la recherche, suggérant la découverte de nouvelles cibles au sein du microbiote intestinal. Il est donc intéressant de noter que l'IPA, un métabolite que nous avons associé à la fibrose hépatique chez l'humain [15], s'est révélé être un composé antifibrotique potentiel dans des modèles animaux [13, 14]. Dans cette étude, nous démontrons pour la première fois une association entre l'IPA sérique et la transcriptomique hépatique globale ainsi que la méthylation de l'ADN chez des individus obèses non diabétiques de type 2 (DT2), mettant en évidence l'apoptose, la mitophagie et la longévité, ainsi qu'un gène candidat potentiel, AKT1, impliqué dans la régulation de l'homéostasie hépatique. Autre nouveauté de notre étude : nous avons démontré l'interaction du traitement par IPA avec l'apoptose, la morphologie cellulaire, la bioénergétique et la dynamique mitochondriales dans les cellules LX-2, indiquant un spectre énergétique plus faible qui oriente le phénotype des cellules stellaires hépatiques vers l'inactivation, faisant de l'IPA un candidat potentiel pour l'amélioration de la fibrose hépatique.
Nous avons constaté que l'apoptose, la mitophagie et la longévité étaient les voies canoniques les plus importantes enrichies dans les gènes hépatiques associés à l'IPA sérique circulante. La perturbation du système de contrôle qualité mitochondrial (MQC) peut entraîner un dysfonctionnement mitochondrial, la mitophagie et l'apoptose, favorisant ainsi l'apparition de la MASLD [33, 34]. Par conséquent, nous pouvons supposer que l'IPA pourrait être impliquée dans le maintien de la dynamique cellulaire et de l'intégrité mitochondriale via l'apoptose, la mitophagie et la longévité dans le foie. Nos données ont montré que deux gènes étaient communs aux trois analyses : YKT6 et AKT1. Il est à noter que YKT6 est une protéine SNARE impliquée dans le processus de fusion des membranes cellulaires. Elle joue un rôle dans l'autophagie et la mitophagie en formant un complexe d'initiation avec STX17 et SNAP29 sur l'autophagosome, favorisant ainsi la fusion des autophagosomes et des lysosomes [35]. De plus, la perte de fonction de YKT6 entraîne une altération de la mitophagie[36], tandis que sa surexpression est associée à la progression du carcinome hépatocellulaire (CHC), témoignant d'une survie cellulaire accrue[37]. Par ailleurs, AKT1 est le gène d'interaction le plus important et joue un rôle majeur dans les maladies hépatiques, notamment dans la voie de signalisation PI3K/AKT, le cycle cellulaire, la migration cellulaire, la prolifération, l'adhérence focale, la fonction mitochondriale et la sécrétion de collagène[38–40]. L'activation de la voie de signalisation PI3K/AKT peut activer les cellules souches hématopoïétiques (CSH), responsables de la production de la matrice extracellulaire (MEC), et son dérèglement peut contribuer à l'apparition et à la progression de la fibrose hépatique[40]. En outre, AKT est un facteur clé de survie cellulaire qui inhibe l'apoptose cellulaire dépendante de p53, et son activation pourrait être associée à l'inhibition de l'apoptose des cellules hépatiques[41, 42]. Les résultats obtenus suggèrent que l'IPA pourrait être impliquée dans l'apoptose mitochondriale hépatique en influençant la décision des hépatocytes entre l'apoptose et la survie. Ces effets pourraient être régulés par les gènes candidats AKT et/ou YKT6, essentiels à l'homéostasie hépatique.
Nos résultats ont montré que l'IPA (1 mM) induisait l'apoptose et diminuait la respiration mitochondriale dans les cellules LX-2, indépendamment du traitement par TGF-β1. Il est important de noter que l'apoptose est une voie majeure de résolution de la fibrose et d'activation des cellules souches hématopoïétiques (CSH), et constitue également un événement clé dans la réponse physiologique réversible de la fibrose hépatique [4, 43]. De plus, la restauration de l'indice de bioénergétique mitochondrial (BHI) dans les cellules LX-2 après traitement combiné a apporté de nouvelles informations sur le rôle potentiel de l'IPA dans la régulation de la bioénergétique mitochondriale. Dans des conditions de repos et d'inactivité, les cellules hématopoïétiques utilisent normalement la phosphorylation oxydative mitochondriale pour produire de l'ATP et présentent une faible activité métabolique. En revanche, l'activation des CSH augmente la respiration et la biosynthèse mitochondriales pour compenser les besoins énergétiques liés à l'entrée en glycolyse [44]. Le fait que l'IPA n'ait pas affecté le potentiel métabolique ni l'ECAR suggère que la voie glycolytique est moins prioritaire. De même, une autre étude a montré que l'IPA à 1 mM était capable de moduler l'activité de la chaîne respiratoire mitochondriale dans les cardiomyocytes, la lignée cellulaire d'hépatocytes humains (Huh7) et les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC). Cependant, aucun effet de l'IPA n'a été observé sur la glycolyse dans les cardiomyocytes, suggérant que l'IPA pourrait affecter la bioénergétique d'autres types cellulaires [45]. Par conséquent, nous supposons que l'IPA à 1 mM pourrait agir comme un découplant chimique doux, puisqu'il peut réduire significativement l'expression des gènes fibrogéniques, la morphologie cellulaire et la bioénergétique mitochondriale sans modifier la quantité d'ADNmt [46]. Les découplants mitochondriaux peuvent inhiber la fibrose induite par la culture et l'activation des cellules stellaires hépatiques [47] et réduire la production d'ATP mitochondriale régulée ou induite par certaines protéines telles que les protéines de découplage (UCP) ou la translocase des nucléotides d'adénine (ANT). Selon le type cellulaire, ce phénomène peut protéger les cellules de l'apoptose et/ou la favoriser [46]. Toutefois, des études complémentaires sont nécessaires pour élucider le rôle de l'IPA en tant que découpleur mitochondrial dans l'inactivation des cellules souches hématopoïétiques.
Nous avons ensuite examiné si les modifications de la respiration mitochondriale se reflétaient dans la morphologie mitochondriale des cellules LX-2 vivantes. Fait intéressant, le traitement au TGF-β1 modifie la proportion mitochondriale, la faisant passer d'une forme sphérique à une forme intermédiaire, avec une diminution de la ramification mitochondriale et une augmentation de l'expression de DRP1, un facteur clé de la fission mitochondriale [48]. De plus, la fragmentation mitochondriale est associée à la complexité globale du réseau, et la transition de la fusion à la fission est cruciale pour l'activation des cellules souches hématopoïétiques (CSH), tandis que l'inhibition de la fission mitochondriale induit l'apoptose des CSH [49]. Ainsi, nos résultats indiquent que le traitement au TGF-β1 pourrait induire une diminution de la complexité du réseau mitochondrial, avec une réduction de la ramification, un phénomène plus fréquent lors de la fission mitochondriale associée aux CSH activées. De plus, nos données ont montré que l'IPA pouvait modifier la proportion de mitochondries, passant d'une forme sphérique à une forme intermédiaire, réduisant ainsi l'expression d'OPA1 et de MFN2. Des études ont démontré que la diminution de l'expression d'OPA1 pouvait entraîner une baisse du potentiel membranaire mitochondrial et déclencher l'apoptose cellulaire [50]. MFN2 est connu pour intervenir dans la fusion mitochondriale et l'apoptose [51]. Les résultats obtenus suggèrent que l'induction des cellules LX-2 par le TGF-β1 et/ou l'IPA semble moduler la forme et la taille des mitochondries, ainsi que leur état d'activation et la complexité du réseau mitochondrial.
Nos résultats indiquent que le traitement combiné de TGFβ-1 et d'IPA pourrait réduire l'ADNmt et modifier les paramètres morphologiques cellulaires en régulant l'expression des ARNm de gènes liés à la fibrose, à l'apoptose et à la survie dans les cellules résistantes à l'apoptose. En effet, l'IPA a diminué le niveau d'expression des ARNm d'AKT1 et de gènes importants de la fibrose tels que COL1A2 et MMP2, tout en augmentant celui de CASP8, associé à l'apoptose. Nos résultats ont montré qu'après traitement par IPA, l'expression de BAX diminuait et celle des ARNm des sous-unités de la famille TIMP1, de BCL-2 et de NF-κB augmentait, suggérant que l'IPA pourrait stimuler les signaux de survie dans les cellules souches hématopoïétiques (CSH) résistantes à l'apoptose. Ces molécules pourraient agir comme signaux de survie dans les cellules souches hématopoïétiques activées, ce qui pourrait être associé à une expression accrue de protéines anti-apoptotiques (telles que Bcl-2), à une expression diminuée de la protéine pro-apoptotique BAX et à une interaction complexe entre TIMP et NF-κB [5, 7]. L'IPA exerce ses effets via PXR, et nous avons constaté qu'un traitement combiné avec TGF-β1 et IPA augmentait les niveaux d'expression de l'ARNm de PXR, indiquant une suppression de l'activation des CSH. Il est connu que la signalisation de PXR activée inhibe l'activation des CSH in vivo et in vitro [52, 53]. Nos résultats indiquent que l'IPA pourrait participer à l'élimination des CSH activées en favorisant l'apoptose, en réduisant la fibrose et le métabolisme mitochondrial, et en renforçant les signaux de survie, autant de processus typiques qui convertissent le phénotype des CSH activées en un phénotype inactivé. Une autre explication possible du mécanisme et du rôle potentiel de l'IPA dans l'apoptose est son élimination des mitochondries dysfonctionnelles, principalement par mitophagie (voie intrinsèque) et via la voie de signalisation extrinsèque du TNF (Tableau 1), directement liée à la voie de signalisation de survie NF-κB (Figure supplémentaire 7). Il est intéressant de noter que les gènes enrichis liés à l'IPA sont capables d'induire des signaux pro-apoptotiques et pro-survie dans la voie apoptotique [54], suggérant que l'IPA pourrait induire l'apoptose ou la survie en interagissant avec ces gènes. Cependant, les mécanismes par lesquels l'IPA induit l'apoptose ou la survie lors de l'activation des cellules souches hématopoïétiques (CSH) restent à élucider.
L'IPA est un métabolite microbien issu du tryptophane alimentaire par le microbiote intestinal. Des études ont démontré ses propriétés anti-inflammatoires, antioxydantes et de régulation épigénétique au niveau intestinal [55]. Il a également été montré que l'IPA module la fonction de barrière intestinale et réduit le stress oxydatif, ce qui pourrait expliquer ses effets physiologiques locaux [56]. En effet, l'IPA est transporté vers ses organes cibles par la circulation sanguine. Partageant une structure métabolique majeure similaire à celle du tryptophane, de la sérotonine et des dérivés de l'indole, l'IPA exerce des actions métaboliques induisant des destins métaboliques compétitifs [52]. L'IPA peut entrer en compétition avec les métabolites dérivés du tryptophane pour les sites de liaison sur les enzymes ou les récepteurs, perturbant potentiellement les voies métaboliques normales. Ceci souligne la nécessité d'études complémentaires sur sa pharmacocinétique et sa pharmacodynamique afin de mieux comprendre sa fenêtre thérapeutique [57]. Il reste à déterminer si ce phénomène s'observe également dans les cellules souches hématopoïétiques (CSH).
Nous reconnaissons que notre étude présente certaines limites. Afin d'examiner spécifiquement les associations liées à l'IPA, nous avons exclu les patients atteints de diabète de type 2 (DT2). Nous reconnaissons que cela limite la généralisation de nos résultats aux patients atteints de diabète de type 2 et d'une maladie hépatique avancée. Bien que la concentration physiologique d'IPA dans le sérum humain soit de 1 à 10 μM [11, 20], une concentration de 1 mM a été choisie en raison de la concentration non toxique la plus élevée [15] et du taux d'apoptose le plus élevé, sans différence significative du pourcentage de cellules nécrotiques. Bien que des concentrations supraphysiologiques d'IPA aient été utilisées dans cette étude, il n'existe actuellement aucun consensus concernant la dose efficace d'IPA [52]. Bien que nos résultats soient significatifs, le devenir métabolique de l'IPA reste un sujet de recherche actif. De plus, nos résultats concernant l'association entre les concentrations sériques d'IPA et la méthylation de l'ADN des transcrits hépatiques ont été obtenus non seulement à partir de cellules souches hématopoïétiques (CSH), mais aussi à partir de tissus hépatiques. Nous avons choisi d'utiliser des cellules humaines LX-2 en nous basant sur nos résultats antérieurs d'analyse du transcriptome montrant que l'IPA est associée à l'activation des cellules souches hématopoïétiques (CSH) [15], et que les CSH sont les principales cellules impliquées dans la progression de la fibrose hépatique. Le foie étant composé de multiples types cellulaires, d'autres modèles cellulaires, tels qu'un système de co-culture hépatocytes-CSH-cellules immunitaires combiné à l'activation des caspases et à la fragmentation de l'ADN, ainsi que le mécanisme d'action, notamment au niveau protéique, devraient être envisagés pour étudier le rôle de l'IPA et son interaction avec d'autres types cellulaires hépatiques.