Différentes théories de la défense des plantes fournissent des orientations théoriques importantes pour expliquer les schémas du métabolisme spécialisé des plantes, mais leurs principales prédictions restent à vérifier. Dans cette étude, nous avons utilisé la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) non biaisée pour explorer systématiquement le métabolome de souches atténuées de tabac, de la plante individuelle aux populations et aux espèces apparentées. Nous avons traité un grand nombre de caractéristiques spectrométriques de masse, basées sur les spectres de composés présents dans le cadre d'analyse, afin de tester les principales prédictions des théories de la défense optimale (DO) et de la cible mobile (TM). La composante informationnelle de la métabolomique végétale est cohérente avec la théorie de la DO, mais contredit la principale prédiction de la théorie de la TM concernant la dynamique métabolomique induite par les herbivores. De l'échelle micro- à l'échelle macro-évolutive, le signal du jasmonate a été identifié comme le principal déterminant de la DO, tandis que le signal de l'éthylène a permis un ajustement fin de la réponse spécifique aux herbivores, mise en évidence par le réseau moléculaire MS/MS.
Les métabolites spécialisés, aux structures diverses, jouent un rôle essentiel dans l'adaptation des plantes à leur environnement, notamment pour se défendre contre leurs ennemis (1). L'extraordinaire diversification du métabolisme spécialisé chez les plantes a stimulé des décennies de recherches approfondies sur ses multiples fonctions écologiques et a donné lieu à de nombreuses théories de la défense végétale, qui décrivent le développement évolutif et écologique des interactions plantes-insectes. La recherche empirique apporte des orientations importantes (2). Cependant, ces théories de la défense végétale n'ont pas suivi la voie normative du raisonnement déductif hypothético-déductif, où les prédictions clés étaient analysées au même niveau (3) et testées expérimentalement pour faire progresser le cycle suivant de développement théorique (4). Les limitations techniques restreignent la collecte de données à des catégories métaboliques spécifiques et excluent une analyse exhaustive des métabolites spécialisés, empêchant ainsi les comparaisons inter-catégorielles pourtant essentielles au développement théorique (5). Le manque de données métabolomiques complètes et d'un référentiel commun pour comparer les processus métaboliques entre différents groupes de plantes freine la maturité scientifique du domaine.
Les dernières avancées en métabolomique par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) permettent de caractériser de manière exhaustive les changements métaboliques au sein et entre les espèces d'un même clade, et peuvent être combinées à des méthodes de calcul pour évaluer la similarité structurale entre ces mélanges complexes. Des connaissances préalables en chimie sont nécessaires (5). L'association de technologies avancées d'analyse et de calcul offre un cadre indispensable à la validation à long terme de nombreuses prédictions issues des théories écologiques et évolutives de la diversité métabolique. Shannon (6) a introduit la théorie de l'information dans son article fondateur de 1948, jetant ainsi les bases de l'analyse mathématique de l'information, qui a depuis trouvé des applications dans de nombreux domaines. En génomique, la théorie de l'information a été appliquée avec succès pour quantifier l'information conservée dans les séquences (7). En transcriptomique, elle analyse les changements globaux du transcriptome (8). Dans des travaux antérieurs, nous avons appliqué le cadre statistique de la théorie de l'information à la métabolomique afin de décrire l'expertise métabolique des tissus végétaux (9). Ici, nous combinons le flux de travail basé sur la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) avec le cadre statistique de la théorie de l'information, caractérisé par la diversité métabolique dans la monnaie commune, afin de comparer les prédictions clés de la théorie de la défense des plantes du métabolome induit par les herbivores.
Les cadres théoriques de la défense des plantes sont généralement interdépendants et peuvent être divisés en deux catégories : ceux qui tentent d’expliquer la distribution des métabolites spécifiques aux plantes en fonction de leurs fonctions de défense, comme la théorie de la défense optimale (DO) (10), la théorie de la cible mobile (TM) (11) et la théorie de l’apparence (12) ; et ceux qui recherchent des explications mécaniques sur la façon dont les variations de disponibilité des ressources affectent la croissance des plantes et l’accumulation de métabolites spécialisés, comme l’hypothèse de l’équilibre carbone/nutriments (13), l’hypothèse du taux de croissance (14) et l’hypothèse de l’équilibre entre croissance et différenciation (15). Ces deux ensembles de théories se situent à différents niveaux d’analyse (4). Cependant, deux théories impliquant les fonctions de défense au niveau fonctionnel dominent le débat sur les défenses constitutives et inductibles des plantes : la théorie de la DO, qui suppose que les plantes investissent dans leurs coûteuses défenses chimiques uniquement lorsque cela est nécessaire, par exemple lorsqu’elles sont ingérées. Lorsqu’un animal attaque une plante, le composé ayant une fonction défensive est alors attribué en fonction de la possibilité d’une attaque future (10). L’hypothèse MT propose l’absence d’axe de variation directionnelle des métabolites, ces derniers évoluant de manière aléatoire, ce qui pourrait entraver la « cible de déplacement » métabolique des herbivores. Autrement dit, ces deux théories formulent des prédictions opposées quant au remodelage métabolique consécutif à l’attaque d’herbivores : la relation entre l’accumulation unidirectionnelle de métabolites à fonction défensive (OD) et les modifications métaboliques non directionnelles (MT) (11).
Les hypothèses OD et MT prennent en compte non seulement les modifications induites du métabolome, mais aussi les conséquences écologiques et évolutives de l'accumulation de ces métabolites, telles que les coûts et bénéfices adaptatifs de ces changements métaboliques dans un environnement écologique spécifique (16). Bien que les deux hypothèses reconnaissent la fonction défensive des métabolites spécialisés, dont le coût peut être variable, la principale différence entre les hypothèses OD et MT réside dans la directionnalité des modifications métaboliques induites. La prédiction de la théorie OD a jusqu'à présent fait l'objet du plus grand nombre d'études expérimentales. Ces études comprennent l'analyse des fonctions de défense directes ou indirectes de différents tissus par des composés spécifiques en serre et en conditions naturelles, ainsi que l'étude des changements de stade de développement des plantes (17-19). Cependant, en raison de l'absence de méthodologie et de cadre statistique permettant une analyse globale et exhaustive de la diversité métabolique de tout organisme, la principale différence prédite par les deux théories (à savoir, la directionnalité des modifications métaboliques) reste à vérifier. Nous présentons ici une telle analyse.
L'une des caractéristiques les plus importantes des métabolites spécifiques aux plantes est leur extrême diversité structurale à tous les niveaux, de la plante isolée aux populations, jusqu'aux espèces similaires (20). De nombreuses variations quantitatives des métabolites spécialisés sont observables à l'échelle de la population, tandis que de fortes différences qualitatives sont généralement maintenues au niveau de l'espèce (20). Par conséquent, la diversité métabolique des plantes est un aspect majeur de leur diversité fonctionnelle, reflétant leur adaptabilité à différentes niches écologiques, notamment celles présentant des possibilités d'invasion variables par des insectes spécifiques et des herbivores communs (21). Depuis l'article fondateur de Fraenkel (22) sur les raisons de l'existence des métabolites spécifiques aux plantes, les interactions avec divers insectes sont considérées comme d'importantes pressions de sélection, et ces interactions auraient façonné les plantes au cours de l'évolution. Voie métabolique (23). Les différences interspécifiques dans la diversité des métabolites spécialisés peuvent également refléter l'équilibre physiologique associé aux mécanismes de défense constitutifs et inductibles des plantes contre les stratégies des herbivores, car les deux espèces sont souvent corrélées négativement (24). Bien qu'il puisse être bénéfique de maintenir une bonne défense en permanence, les modifications métaboliques opportunes associées à la défense offrent des avantages indéniables : elles permettent aux plantes d'allouer des ressources précieuses à d'autres investissements physiologiques (19, 24) et d'éviter le recours à la symbiose. Les dommages collatéraux (25) sont ainsi évités. De plus, ces réorganisations des métabolites spécialisés, induites par les insectes herbivores, peuvent entraîner une distribution destructive au sein de la population (26) et refléter directement des variations naturelles importantes du signal de l'acide jasmonique (AJ), susceptibles de se maintenir dans la population. Les signaux AJ, qu'ils soient élevés ou faibles, représentent un compromis entre la défense contre les herbivores et la compétition avec des espèces spécifiques (27). Par ailleurs, les voies de biosynthèse des métabolites spécialisés subissent des pertes et des transformations rapides au cours de l'évolution, ce qui engendre une distribution métabolique hétérogène parmi les espèces étroitement apparentées (28). Ces polymorphismes peuvent s'établir rapidement en réponse à l'évolution des comportements des herbivores (29), ce qui signifie que la fluctuation des communautés d'herbivores est un facteur clé de l'hétérogénéité métabolique.
Nous avons ici spécifiquement résolu les problèmes suivants : (I) Comment l’insecte herbivore reconfigure-t-il le métabolome de la plante ? (II) Quels sont les principaux éléments d’information de la plasticité métabolique quantifiables pour tester les prédictions de la théorie de la défense à long terme ? (III) La plante reprogramme-t-elle son métabolome de manière spécifique à l’agresseur ? Si oui, quel rôle jouent les hormones végétales dans l’élaboration d’une réponse métabolique spécifique, et quels métabolites contribuent à la spécificité de la défense ? (IV) Les prédictions de nombreuses théories de la défense étant généralisables à tous les niveaux des tissus biologiques, nous avons cherché à évaluer la cohérence de la réponse métabolique induite entre les comparaisons intraspécifiques et interspécifiques. À cette fin, nous avons étudié systématiquement le métabolome foliaire du tabac *Natura nasi*, une plante modèle écologique dotée d'un métabolisme spécialisé complexe et efficace contre les larves de deux herbivores indigènes : *Datura nasi* (Lépidoptères très agressifs, principalement consommés) appartenant à la famille des Solanacées, et *Spodoptera littoralis* (Lépidoptères du littoral). Ces derniers constituent un genre à part entière, leurs plantes hôtes appartenant à la famille des Solanacées ainsi qu'à d'autres genres et familles. Nous avons analysé le spectre métabolomique MS/MS et extrait des descripteurs statistiques issus de la théorie de l'information afin de comparer les théories de la dénaturation (OD) et de la métabolisation (MT). Des cartes de spécificité ont été créées pour identifier les métabolites clés. L'analyse a été étendue à la population indigène de *Natura nasi* et à des espèces de tabac apparentées afin d'étudier plus en détail la covariance entre la signalisation hormonale végétale et l'induction de la dénaturation.
Afin d'établir une cartographie globale de la plasticité et de la structure du métabolome foliaire du tabac herbivore, nous avons utilisé un flux de travail d'analyse et de calcul précédemment développé pour collecter et déconvoluer de manière exhaustive des spectres MS/MS haute résolution indépendants d'extraits végétaux (9). Cette méthode non différenciée (appelée MS/MS) permet de construire des spectres de composés non redondants, utilisables pour toutes les analyses au niveau des composés décrites ici. Ces métabolites végétaux déconvolués sont de types variés, comprenant des centaines voire des milliers de métabolites (environ 500 à 1 000 s/MS/MS dans cette étude). Nous considérons ici la plasticité métabolique dans le cadre de la théorie de l'information et quantifions la diversité et la spécialisation du métabolome à partir de l'entropie de Shannon de la distribution des fréquences métaboliques. À l'aide de la formule précédemment implémentée (8), nous avons calculé un ensemble d'indicateurs permettant de quantifier la diversité du métabolome (indicateur Hj), la spécialisation du profil métabolique (indicateur δj) et la spécificité métabolique d'un métabolite donné (indicateur Si). De plus, nous avons appliqué l'indice de plasticité de distance relative (RDPI) pour quantifier l'inductibilité du métabolome par les herbivores (Figure 1A) (30). Dans ce cadre statistique, nous considérons le spectre MS/MS comme l'unité d'information de base et transformons l'abondance relative des spectres MS/MS en une carte de distribution de fréquence. L'entropie de Shannon est ensuite utilisée pour estimer la diversité du métabolome. La spécialisation du métabolome est mesurée par la spécificité moyenne d'un spectre MS/MS. Ainsi, l'augmentation de l'abondance de certaines classes MS/MS après l'induction par les herbivores se traduit par une inductibilité spectrale, un RDPI et une spécialisation accrus, c'est-à-dire une augmentation de l'indice δj, due à la production de métabolites plus spécialisés et à un indice Si élevé. La diminution de l'indice de diversité Hj reflète soit une réduction du nombre de spectres MS/MS générés, soit une modification moins uniforme de la distribution de fréquence des profils, tout en réduisant son incertitude globale. Le calcul de l'indice Si permet de mettre en évidence les MS/MS induits par certains herbivores, et au contraire, les MS/MS qui ne répondent pas à l'induction, ce qui constitue un indicateur clé pour distinguer les prédictions MT et OD.
(A) Descripteurs statistiques utilisés pour l'inductibilité des données MS/MS (RDPI), la diversité (indice Hj), la spécialisation (indice δj) et la spécificité des métabolites (indice Si) chez les herbivores (H1 à Hx). Une augmentation du degré de spécialisation (δj) indique qu'en moyenne, davantage de métabolites spécifiques aux herbivores seront produits, tandis qu'une diminution de la diversité (Hj) indique une diminution de la production de métabolites ou une distribution hétérogène de ces derniers. La valeur Si évalue si le métabolite est spécifique à une condition donnée (ici, herbivore) ou, au contraire, maintenu au même niveau. (B) Schéma conceptuel de la prédiction de la théorie de la défense selon l'axe de la théorie de l'information. La théorie de la défense prédit qu'une attaque d'herbivores augmentera la production de métabolites de défense, augmentant ainsi δj. Simultanément, Hj diminue car le profil se réorganise en fonction de la réduction de l'incertitude de l'information métabolique. La théorie MT prédit que l'attaque d'herbivores induira des modifications non directionnelles du métabolome, augmentant ainsi Hj, indicateur d'une incertitude accrue de l'information métabolique, et provoquant une distribution aléatoire de Si. Nous avons également proposé un modèle mixte, le modèle MT optimal, dans lequel certains métabolites à forte valeur défensive seront particulièrement abondants (valeur de Si élevée), tandis que d'autres présenteront des réponses aléatoires (valeur de Si plus faible).
En utilisant les descripteurs de la théorie de l'information, nous interprétons la théorie OD pour prédire que les modifications métaboliques spécifiques induites par les herbivores dans un état constitutif non induit entraîneront (i) une augmentation de la spécificité métabolique (indice Si) induisant une spécificité métabolomique (indice δj) – soit l'augmentation de certains groupes de métabolites spécifiques à forte valeur de défense – et (ii) une diminution de la diversité du métabolome (indice Hj) due à une modification de la distribution des fréquences métaboliques vers une distribution corporelle plus importante de la leptine. Au niveau d'un métabolite individuel, une distribution ordonnée de Si est attendue, où la valeur de Si augmente en fonction de la valeur de défense du métabolite (Figure 1B). Dans cette optique, nous expliquons la théorie MT pour prédire que l'excitation entraînera (i) des modifications non directionnelles des métabolites, se traduisant par une diminution de l'indice δj, et (ii) une augmentation de l'indice Hj due à une augmentation de l'incertitude métabolique, ou du caractère aléatoire, qui peut être quantifié par l'entropie de Shannon sous la forme d'une diversité généralisée. Quant à la composition métabolique, la théorie MT prédit une distribution aléatoire de Si. Compte tenu du fait que certains métabolites sont dans des conditions spécifiques et que d'autres ne le sont pas, et que leur valeur de défense dépend de l'environnement, nous avons également proposé un modèle de défense mixte, dans lequel δj et Hj sont distribués en deux le long de Si. En augmentant dans toutes les directions, seuls certains groupes de métabolites, qui ont des valeurs de défense plus élevées, augmenteront particulièrement Si, tandis que les autres auront une distribution aléatoire (Figure 1B).
Afin de tester la prédiction de la théorie de la défense redéfinie sur l'axe du descripteur de la théorie de l'information, nous avons élevé des larves d'herbivores experts (Ms) ou généralistes (Sl) sur des feuilles de *Nepenthes pallens* (Figure 2A). Par analyse MS/MS, nous avons obtenu 599 spectres MS/MS non redondants (fichier de données S1) à partir d'extraits méthanoliques de tissus foliaires prélevés après l'alimentation des chenilles. L'utilisation des indices RDPI, Hj et δj pour visualiser la reconfiguration du contenu informationnel dans les fichiers de configuration MS/MS révèle des tendances intéressantes (Figure 2B). La tendance générale est que, comme décrit par le descripteur d'information, à mesure que les chenilles continuent de se nourrir de feuilles, le degré de réorganisation métabolique augmente avec le temps : 72 heures après l'alimentation de l'herbivore, le RDPI augmente significativement. Comparé au témoin non endommagé, l'indice Hj est significativement réduit, ce qui est dû au degré accru de spécialisation du profil métabolique, quantifié par l'indice δj. Cette tendance apparente est cohérente avec les prédictions de la théorie OD, mais contredit les principales prédictions de la théorie MT, selon laquelle les variations aléatoires (non directionnelles) des concentrations de métabolites servent de camouflage défensif (Figure 1B). Bien que la composition en éliciteurs des sécrétions orales (SO) et le comportement alimentaire de ces deux herbivores diffèrent, leur alimentation directe a induit des variations similaires des valeurs de Hj et δj au cours des périodes de prélèvement de 24 et 72 heures. La seule différence observée est apparue à 72 heures après l'ingestion. Comparé à celui induit par l'alimentation de Ms, le métabolisme global induit par l'alimentation de Sl était plus élevé.
(A) Protocole expérimental : des porcs communs (S1) ou des herbivores experts (Ms) sont nourris avec des feuilles désalinisées de plantes carnivores. Pour simuler l’herbivorie, le système d’alimentation de Ms (W + OSMs) est utilisé pour induire des plaies à des emplacements standardisés sur les feuilles. S1 (W + OSMs) est nourri avec des larves ou de l’eau (W + W). Le témoin (C) est une feuille intacte. (B) Indices d’inductibilité (RDPI comparé au témoin), de diversité (indice Hj) et de spécialisation (indice δj) calculés pour la carte métabolique spécifique (599 MS/MS ; fichier de données S1). Les astérisques indiquent des différences significatives entre l’alimentation directe des herbivores et le groupe témoin (test t de Student avec test t apparié, *P < 0,05 et ***P < 0,001). ns : non significatif. (C) Indice de résolution temporelle des principaux métabolites (encadré bleu : acides aminés, acides organiques et sucres ; fichier de données S2) et du spectre des métabolites spécifiques (encadré rouge : MS/MS 443 ; fichier de données S1) après simulation d’herbivorie. La couleur représente l’intervalle de confiance à 95 %. L’astérisque indique une différence significative entre le traitement et le témoin [analyse de variance quadratique (ANOVA), suivie du test HSD de Tukey pour les comparaisons multiples post hoc, * p < 0,05, ** p < 0,01 et *** p < 0,001]. (D) Détails des nuages ​​de points et des profils de métabolites spécifiques (échantillons répétés avec différents traitements).
Afin d'explorer si le remodelage du métabolome induit par les herbivores se traduit par des variations de concentration de métabolites individuels, nous nous sommes d'abord intéressés aux métabolites précédemment étudiés dans les feuilles de *Nepenthes pallens*, une espèce reconnue pour sa résistance aux herbivores. Les amides phénoliques sont des conjugués d'hydroxycinnamamide et de polyamine qui s'accumulent lors de l'herbivorie par les insectes et sont connus pour réduire leurs performances (32). Nous avons recherché les précurseurs des composés correspondants par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) et tracé leurs courbes cinétiques cumulatives (Figure S1). Sans surprise, les dérivés phénoliques non directement impliqués dans la défense contre les herbivores, tels que l'acide chlorogénique (CGA) et la rutine, sont sous-exprimés après l'herbivorie. En revanche, les herbivores peuvent rendre les amides phénoliques très actifs. L'alimentation continue des deux herbivores a induit des spectres d'excitation des phénolamides quasi identiques, et ce phénomène était particulièrement marqué pour la synthèse de novo de ces composés. Le même phénomène sera observé lors de l'exploration de la voie des glycosides de diterpènes 17-hydroxygéranyl nonanediol (17-HGL-DTG), qui produit un grand nombre de diterpènes acycliques aux fonctions anti-herbivores efficaces (33), dont l'alimentation de Ms avec Sl a déclenché un profil d'expression similaire (Figure S1)).
L'inconvénient potentiel des expériences d'alimentation directe des herbivores réside dans la variabilité du taux de consommation foliaire et de la durée d'alimentation, ce qui rend difficile l'élimination des effets spécifiques à chaque herbivore induits par les blessures et les herbivores eux-mêmes. Afin de mieux appréhender la spécificité de la réponse métabolique foliaire induite selon l'espèce d'herbivore, nous avons simulé l'alimentation des larves de Ms et Sl en appliquant immédiatement l'OS fraîchement prélevé (OSM et OSS1) au point de ponction standard W, à des positions foliaires constantes. Ce protocole, appelé traitement W + OS, standardise l'induction en synchronisant précisément le déclenchement de la réponse provoquée par l'herbivore, sans introduire d'effets confondants liés aux différences de taux ou de quantité de perte tissulaire (Figure 2A) (34). À l'aide du pipeline d'analyse et de calcul MS/MS, nous avons obtenu 443 spectres MS/MS (fichier de données S1), qui se superposent aux spectres précédemment assemblés à partir d'expériences d'alimentation directe. L'analyse de la théorie de l'information de cet ensemble de données MS/MS a montré que la reprogrammation des métabolomes spécialisés des feuilles par simulation d'herbivores présentait des inductions spécifiques à l'OS (Figure 2C). En particulier, comparativement au traitement OSS1, l'OSM a induit une augmentation de la spécialisation du métabolome après 4 heures. Il est à noter que, comparativement aux données expérimentales d'alimentation directe des herbivores, la cinétique métabolique visualisée dans un espace bidimensionnel à l'aide de Hj et δj comme coordonnées et la direction de la spécialisation du métabolome en réponse au traitement par simulation d'herbivores augmentent de manière cohérente au cours du temps (Figure 2D). Parallèlement, nous avons quantifié la teneur en acides aminés, en acides organiques et en sucres (fichier de données S2) afin de déterminer si cette augmentation ciblée de l'expertise du métabolome est due à la reconfiguration du métabolisme central du carbone en réponse aux herbivores simulés (Figure S2). Pour mieux expliquer ce phénomène, nous avons également suivi la cinétique d'accumulation métabolique des voies de la phénolamide et du 17-HGL-DTG précédemment décrites. L'induction spécifique des herbivores par OS se traduit par un réarrangement différentiel du métabolisme des phénolamides (Figure S3). Les amides phénoliques contenant des groupements coumarine et caféoyle sont induits préférentiellement par OSS1, tandis que les OSM induisent spécifiquement la formation de conjugués de férulyle. Concernant la voie 17-HGL-DTG, une induction différentielle d'OS par les produits de malonylation et de dimalonylation en aval a été observée (Figure S3).
Nous avons ensuite étudié la plasticité du transcriptome induite par le stress oxydatif (OS) à l'aide d'un jeu de données de microarrays cinétiques, simulant l'utilisation d'OSM pour traiter les feuilles de la plante en rosette chez les herbivores. La cinétique d'échantillonnage est globalement similaire à celle utilisée dans cette étude métabolomique (35). Contrairement à la reconfiguration du métabolome, où la plasticité métabolique augmente considérablement au fil du temps, nous observons des pics de transcription transitoires dans les feuilles induits par le stress oxydatif, où l'inductibilité du transcriptome (RDPI) et la spécialisation (δj) sont à 1 heure. À ce stade, l'expression de BMP1 est significativement réduite, suivie d'un relâchement de la spécialisation du transcriptome (Figure S4). Les familles de gènes métaboliques (telles que P450, les glycosyltransférases et les acyltransférases BAHD) participent à l'assemblage de métabolites spécifiques à partir d'unités structurales issues du métabolisme primaire, conformément au modèle de spécialisation précoce mentionné précédemment. La voie de la phénylalanine a été analysée à titre d'exemple. L'analyse a confirmé que les gènes clés du métabolisme des phénolamides sont fortement induits par le stress oxydatif chez les herbivores, comparativement aux plantes non attirées, et que leurs profils d'expression sont étroitement alignés. Le facteur de transcription MYB8 et les gènes structuraux PAL1, PAL2, C4H et 4CL, situés en amont de cette voie métabolique, présentent une initiation précoce de la transcription. Les acyltransférases impliquées dans l'assemblage final des phénolamides, telles que AT1, DH29 et CV86, présentent une surexpression prolongée (Figure S4). Ces observations indiquent que l'initiation précoce de la spécialisation du transcriptome et l'amplification ultérieure de la spécialisation métabolomique constituent un mode couplé, probablement dû à un système de régulation synchrone initiant une réponse de défense efficace.
La reconfiguration de la signalisation des hormones végétales agit comme une couche régulatrice intégrant les informations relatives aux herbivores afin de reprogrammer la physiologie des plantes. Après la simulation de l'herbivorie, nous avons mesuré la dynamique cumulative des principales catégories d'hormones végétales et visualisé leur co-expression temporelle [coefficient de corrélation de Pearson (PCC) > 0,4] (Figure 3A). Comme prévu, les hormones végétales impliquées dans la biosynthèse sont liées au sein du réseau de co-expression hormonale. De plus, la spécificité métabolique (indice Si) est cartographiée sur ce réseau afin de mettre en évidence les hormones végétales induites par différents traitements. Deux zones principales de réponse spécifique aux herbivores sont identifiées : l'une se situe dans le cluster JA, où le JA (sa forme biologiquement active, le JA-Ile) et d'autres dérivés du JA présentent le score Si le plus élevé ; l'autre concerne l'éthylène (ET). La gibbérelline n'a montré qu'une augmentation modérée de la spécificité pour les herbivores, tandis que d'autres hormones végétales, telles que la cytokinine, l'auxine et l'acide abscissique, ont présenté une faible spécificité d'induction pour les herbivores. Comparativement à l'utilisation de W + W seul, l'amplification de la valeur maximale des dérivés de JA par l'application d'OS (W + OS) permet de constituer un indicateur spécifique et performant des JA. De façon inattendue, OSM et OSS1, présentant des concentrations différentes d'éliciteur, induisent une accumulation similaire de JA et de JA-Ile. Contrairement à OSS1, OSM est spécifiquement et fortement induit par OSM, tandis qu'OSS1 n'amplifie pas la réponse aux lésions basales (Figure 3B).
(A) Analyse du réseau de co-expression basée sur le calcul du coefficient de corrélation de Pearson (PCC) de la simulation de la cinétique d'accumulation des hormones végétales induite par les herbivores. Chaque nœud représente une hormone végétale et sa taille correspond à l'indice Si spécifique à cette hormone entre les traitements. (B) Accumulation de JA, JA-Ile et ET dans les feuilles suite à différents traitements, indiqués par différentes couleurs : abricot, W + OSM ; bleu, W + OSM ; noir, W + W ; gris, C (témoin). Les astérisques indiquent des différences significatives entre le traitement et le témoin (ANOVA à deux facteurs suivie d'un test post-hoc de Tukey HSD, *** p < 0,001). Analyse de la théorie de l'information des spectres MS/MS (C) 697 (fichier de données S1) de la biosynthèse de JA et du spectre de perception altéré (irAOC et irCOI1) et (D) 585 (fichier de données S1) de l'ETR1 avec un signal ET altéré. Deux traitements simulés par des herbivores ont été appliqués aux lignées végétales et aux plantes témoins (véhicule vide, EV). Les astérisques indiquent des différences significatives entre le traitement W+OS et le témoin non endommagé (ANOVA à deux facteurs suivie d'un test post-hoc de comparaisons multiples de Tukey HSD, *P<0,05, **P<0,01 et ***P<0,001). (E) Graphiques de dispersion de l'opposition à la spécialisation. Les couleurs représentent différentes souches génétiquement modifiées ; les symboles représentent différentes méthodes de traitement : triangle, W + OSS1 ; rectangle, W + OSM ; cercle C
Nous avons ensuite utilisé une souche atténuée de Nepenthes génétiquement modifiée (irCOI1 et sETR1) au niveau des étapes clés de la biosynthèse (irAOC et irACO) et de la perception (irCOI1 et sETR1) de l'acide jasmonique (JA) et de l'éthylène (ET) afin d'analyser le métabolisme de ces deux hormones végétales chez les herbivores et la contribution relative de la reprogrammation. Conformément aux expériences précédentes, nous avons confirmé l'induction de la réponse d'herbivorie (OS) chez les plantes porteuses vides (EV) (Figure 3, C à D) et la diminution globale de l'indice Hj induite par OSM, tandis que l'indice δj augmentait. La réponse est plus marquée que celle déclenchée par OSS1. Un graphique à deux courbes, utilisant Hj et δj comme coordonnées, illustre la dérégulation spécifique (Figure 3E). La tendance la plus évidente est que, chez les souches dépourvues de signal JA, la diversité du métabolome et les modifications de spécialisation induites par les herbivores sont presque totalement éliminées (Figure 3C). En revanche, la perception silencieuse de l'ET chez les plantes sETR1, bien que son effet global sur les modifications du métabolisme des herbivores soit bien inférieur à celui de la signalisation JA, atténue la différence des indices Hj et δj entre les stimulations OSM et OSS1 (figures 3D et S5). Ceci indique qu'en plus de sa fonction principale de transduction du signal JA, la transduction du signal ET contribue également à la régulation fine de la réponse métabolique spécifique aux herbivores. Conformément à cette fonction de régulation fine, aucune modification de l'inductibilité globale du métabolome n'a été observée chez les plantes sETR1. Par ailleurs, comparées aux plantes sETR1, les plantes irACO ont induit des amplitudes globales de modifications métaboliques similaires aux effets des herbivores, mais ont présenté des scores Hj et δj significativement différents entre les stimulations OSM et OSS1 (figure S5).
Afin d'identifier les métabolites spécialisés contribuant de manière significative à la réponse spécifique des herbivores et d'optimiser leur production grâce aux signaux ET, nous avons utilisé la méthode MS/MS structurale précédemment développée. Cette méthode repose sur le bi-clustering pour réinférer la famille métabolique à partir des fragments MS/MS [produit scalaire normalisé (NDP)] et d'un score de similarité basé sur la perte neutre (NL). L'ensemble de données MS/MS, construit par l'analyse de lignées transgéniques ET, a produit 585 spectres MS/MS (fichier de données S1), qui ont été regroupés en sept modules MS/MS principaux (M) (Figure 4A). Certains de ces modules sont riches en métabolites spécialisés déjà caractérisés : par exemple, M1, M2, M3, M4 et M7 sont riches en divers dérivés phénoliques (M1), glycosides de flavonoïdes (M2), acylesucres (M3 et M4) et 17-HGL-DTG (M7). De plus, l'information métabolique spécifique (indice Si) de chaque métabolite dans chaque module est calculée, et sa distribution Si est visualisable. En bref, les spectres MS/MS présentant une forte spécificité d'herbivorie et de génotype sont caractérisés par des valeurs Si élevées, et les statistiques de kurtosis indiquent la distribution des poils sur le coin droit de la queue. Une telle distribution colloïdale maigre a été détectée dans M1, où le phénolamide présentait la fraction Si la plus élevée (Figure 4B). Le 17-HGL-DTG inductible par l'herbivorie mentionné précédemment dans M7 présentait un score Si modéré, indiquant un degré modéré de régulation différentielle entre les deux types d'OS. En revanche, la plupart des métabolites spécialisés produits de manière constitutive, tels que la rutine, le CGA et les acylsucres, figurent parmi les scores Si les plus faibles. Afin de mieux explorer la complexité structurale et la distribution Si entre les métabolites spécialisés, un réseau moléculaire a été construit pour chaque module (Figure 4B). Une prédiction importante de la théorie OD (résumée dans la figure 1B) est que la réorganisation des métabolites spécifiques après herbivorie devrait entraîner des modifications unidirectionnelles des métabolites à forte valeur défensive, notamment en augmentant leur spécificité (par opposition à une distribution aléatoire). Métabolite défensif prédit par la théorie MT. La plupart des dérivés phénoliques accumulés dans M1 sont fonctionnellement liés à la diminution des performances des insectes (32). En comparant les valeurs Si des métabolites M1 entre les feuilles induites et les feuilles constitutives des plantes témoins EV après 24 heures, nous avons observé que la spécificité métabolique de nombreux métabolites après herbivorie présente une tendance à la hausse significative (figure 4C). L'augmentation spécifique de la valeur Si a été détectée uniquement dans les phénolamides défensifs, mais aucune augmentation de la valeur Si n'a été détectée dans les autres phénols et les métabolites inconnus coexistant dans ce module. Il s'agit d'un modèle spécialisé, lié à la théorie OD. Les principales prédictions des changements métaboliques causés par les herbivores sont cohérentes. Afin de déterminer si cette particularité du spectre des phénolamides était induite par l'ET spécifique à OS, nous avons représenté graphiquement l'indice Si des métabolites et observé une différence d'expression entre OSM et OSS1 dans les génotypes EV et sETR1 (Figure 4D). Dans sETR1, la différence induite par les phénolamides entre OSM et OSS1 était fortement réduite. La méthode de bi-clustering a également été appliquée aux données MS/MS collectées dans les souches présentant une carence en JA afin d'identifier les principaux modules MS/MS liés à la spécialisation métabolique régulée par le JA (Figure S6).
(A) Le regroupement de 585 spectres MS/MS, basé sur la similarité des fragments partagés (NDP) et des pertes neutres partagées (NL), indique que le module (M) correspond soit à une famille de composés connue, soit à une composition en métabolites inconnue ou faiblement métabolisée. La distribution spécifique (Si) des métabolites (MS/MS) est affichée à côté de chaque module. (B) Réseau moléculaire modulaire : les nœuds représentent les spectres MS/MS et les arêtes, les scores MS/MS NDP (rouge) et NL (bleu) (seuil > 0,6). L’indice de spécificité des métabolites (Si) est coloré en fonction du module (à gauche) et représenté sur le réseau moléculaire (à droite). (C) Module M1 de la plante EV à l’état constitutif (témoin) et à l’état induit (herbivore simulé) après 24 heures : diagramme du réseau moléculaire (la valeur Si correspond à la taille du nœud ; le phénolamide de défense est mis en évidence en bleu). (D) Diagramme du réseau moléculaire M1 de la raie spectrale sETR1 avec perception altérée des EV et ET : le composé phénolique est représenté par le nœud circulaire vert, et la différence significative (valeur P) entre les traitements W + OSM et W + OSM est indiquée par la taille du nœud. CP : N-caféoyl-tyrosine ; CS : N-caféoyl-spermidine ; FP : ester d’acide N-férulique-acide urique ; FS : N-férulyl-spermidine ; CoP : N',N''-coumarolyl-tyrosine ; DCS : N',N''-dicaféoyl-spermidine ; CFS : N',N''-caféoyl-féruloyl-spermidine ; Lycium barbarum in wolfberry Son ; Nick. O-AS : O-acyl sucre.
Nous avons étendu l'analyse d'un seul génotype atténué de Nepenthes aux populations naturelles, où de fortes variations intraspécifiques des niveaux d'acide jasmonique (JA) et de métabolites spécifiques induites par les herbivores ont été décrites précédemment (26). Cet ensemble de données couvre 43 génotypes. Ces génotypes comprennent 123 espèces de plantes de N. pallens. Ces plantes proviennent de graines récoltées dans différents habitats naturels de l'Utah, du Nevada, de l'Arizona et de la Californie (Figure S7). Nous avons calculé la diversité du métabolome (ici appelée diversité β au niveau de la population) et la spécialisation induite par l'OSM. Conformément aux études précédentes, nous avons observé une large gamme de variations métaboliques le long des axes Hj et δj, indiquant que les génotypes présentent des différences significatives dans la plasticité de leurs réponses métaboliques aux herbivores (Figure S7). Cette organisation rappelle les observations précédentes concernant la gamme dynamique des variations de JA induites par les herbivores et a conservé une valeur très élevée au sein d'une même population (26, 36). En utilisant JA et JA-Ile pour tester la corrélation globale entre Hj et δj, nous avons constaté une corrélation positive significative entre JA et l'indice de diversité et de spécialisation du métabolome β (Figure S7). Ceci suggère que l'hétérogénéité de l'induction des JA induite par les herbivores, détectée au niveau de la population, pourrait être due à des polymorphismes métaboliques clés causés par la sélection exercée par les insectes herbivores.
Des études antérieures ont montré que les variétés de tabac diffèrent considérablement par leur type et leur dépendance relative aux défenses métaboliques induites et constitutives. On pense que ces modifications de la transduction du signal anti-herbivore et des capacités de défense sont régulées par la pression démographique des insectes, le cycle de vie de la plante et les coûts de production des défenses dans la niche écologique de l'espèce. Nous avons étudié la constance du remodelage du métabolome foliaire induit par les herbivores chez six espèces de Nicotiana originaires d'Amérique du Nord et du Sud. Ces espèces sont étroitement apparentées à Nepenthes North America, à savoir Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. atténuée (graminée), Nicotiana tabacum, tabac linéaire, tabac (Nicotiana spegazzinii) et tabac à feuilles obtusifoliées (Nicotiana obtusifolia) (Figure 5A) (37). Six de ces espèces, dont l'espèce bien caractérisée N. pl., sont des plantes annuelles du clade des pétunias, tandis que N. obtusifolia est une plante vivace du clade frère des Trigonophyllae (38). Par la suite, l'induction de W + W, W + OSM et W + OSS1 a été réalisée sur ces sept espèces pour étudier le réarrangement métabolique au niveau de l'espèce de l'alimentation des insectes.
(A) Arbre phylogénétique bootstrap basé sur le maximum de vraisemblance [pour la synthèse nucléaire de glutamine (38)] et la distribution géographique de sept espèces de Nicotiana étroitement apparentées (couleurs différentes) (37). (B) Nuage de points représentant la diversité spécialisée des profils métaboliques de sept espèces de Nicotiana (939 MS/MS ; fichier de données S1). Au niveau de l’espèce, la diversité du métabolome est inversement corrélée au degré de spécialisation. L’analyse de la corrélation au niveau de l’espèce entre la diversité métabolique, la spécialisation et l’accumulation de JA est présentée dans la figure 2. S9. Couleur : différents types ; triangle : W + OSS1 ; rectangle : W + OSM. (C) La dynamique de JA et de JA-Ile chez Nicotiana est classée selon l’amplitude d’excitation OS (ANOVA à deux facteurs et test post-hoc HSD de Tukey, * p < 0,05, ** p < 0,01 et *** p < 0,001 pour la comparaison entre W + OS et W + W). Diagramme en boîte de la diversité (D) et de la spécialisation (E) de chaque espèce après simulation d'herbivorie et de méthyljasmonate (MeJA). L'astérisque indique la différence significative entre W + OS et W + W ou lanoline plus W (Lan + W) ou Lan plus MeJA (Lan + MeJa) et le témoin Lan (analyse de variance à deux facteurs, suivie du test post-hoc de comparaisons multiples HSD de Tukey, *P < 0,05, **P < 0,01 et ***P < 0,001).
À l'aide de la méthode de double regroupement, nous avons identifié 9 modules parmi 939 spectres MS/MS (fichier de données S1). La composition des spectres MS/MS, reconfigurés par différents traitements, varie considérablement d'un module à l'autre et d'une espèce à l'autre (Figure S8). La visualisation de Hj (désignée ici comme la diversité gamma au niveau de l'espèce) et de δj révèle que les différentes espèces se regroupent en structures très distinctes dans l'espace métabolique, où la division au niveau de l'espèce est généralement plus marquée que l'excitation. À l'exception de N. linear et N. obliquus, ces espèces présentent une large gamme dynamique d'effets d'induction (Figure 5B). En revanche, des espèces telles que N. purpurea et N. obtusifolia présentent une réponse métabolique moins évidente au traitement, mais leur métabolome est plus diversifié. La distribution spécifique à l'espèce de la réponse métabolique induite a mis en évidence une corrélation négative significative entre la spécialisation et la diversité gamma (PCC = -0,46, p = 4,9 × 10⁻⁸). Les variations des niveaux de JA induites par le stress oxydatif sont positivement corrélées à la spécialisation du métabolome et négativement corrélées à la diversité métabolique gamma de chaque espèce (figures 5B et S9). Il est à noter que les espèces communément appelées « espèces sensibles au signal » (figure 5C), telles que les nématodes du genre Nepenthes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute et Nepenthes attenuated, ont induit des changements significatifs après 30 minutes. Ces changements sont liés aux récentes épidémies de JA et de JA-Ile spécifiques au stress oxydatif, tandis que d'autres bactéries dites « non sensibles au signal », comme Nepenthes mills, Nepenthes powdery et N. obtusifolia, présentent uniquement une induction de JA-Ile Edge sans spécificité pour le stress oxydatif (figure 5C). Au niveau métabolique, comme mentionné précédemment, chez Nepenthes attenuated, les substances sensibles au signal ont montré une spécificité pour le stress oxydatif et ont augmenté significativement δj, tout en réduisant Hj. Cet effet d'amorçage spécifique à l'OS n'a pas été détecté chez les espèces classées comme non réactives au signal (Figure 5, D et E). Les métabolites spécifiques à l'OS sont plus fréquemment partagés entre les espèces réactives au signal, et ces groupes de signaux se regroupent avec des espèces présentant des réponses au signal plus faibles, tandis que ces dernières présentent une interdépendance moindre (Figure S8). Ce résultat indique que l'induction spécifique à l'OS des JA et la reconfiguration spécifique à l'OS du métabolome en aval sont couplées au niveau de l'espèce.
Nous avons ensuite utilisé une pâte de lanoline contenant du méthyl-JA (MeJA) pour traiter des plantes et étudier si ces modes de couplage sont limités par la disponibilité du JA apporté par l'apport exogène, présent dans le cytoplasme des plantes. La désestérification rapide du JA est observée. Nous avons constaté la même tendance à la transition progressive d'espèces sensibles au signal vers des espèces insensibles au signal, induite par un apport continu de JA (Figure 5, D et E). En résumé, le traitement au MeJA a fortement reprogrammé les métabolomes des nématodes linéaires N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens et N. mikimotoi, entraînant une augmentation significative de δj et une diminution de Hj. N. purpurea a uniquement montré une augmentation de δj, sans modification de Hj. N. obtusifolia, connu pour accumuler de très faibles quantités de JA, réagit également faiblement au traitement au MeJA en termes de reconfiguration du métabolome. Ces résultats indiquent que la production de JA ou la transduction du signal est physiologiquement limitée chez les espèces insensibles au signal. Pour tester cette hypothèse, nous avons étudié les transcriptomes de quatre espèces (N. pallens, N. mills, N. pink et N. microphylla) induits par W + W, W + OSMs et W + OSS1 (39). Conformément au modèle de remodelage du métabolome, les espèces sont bien séparées dans l'espace transcriptomique. Parmi elles, N. attenuated a présenté le RDPI induit par OS le plus élevé, tandis que N. gracilis a présenté le plus faible (Figure 6A). Cependant, la diversité du transcriptome induite par N. oblonga s'est avérée la plus faible des quatre espèces, contrairement à la diversité métabolomique la plus élevée observée chez N. oblonga chez sept espèces. Des études antérieures ont montré qu'un ensemble de gènes liés aux signaux de défense précoces, notamment les signaux JA, explique la spécificité des réponses de défense précoces induites par les éliciteurs liés aux herbivores chez les espèces de Nicotiana (39). La comparaison des voies de signalisation JA entre ces quatre espèces a révélé un profil intéressant (Figure 6B). La plupart des gènes de cette voie métabolique, tels que AOC, OPR3, ACX et COI1, ont présenté des niveaux d'induction relativement élevés chez ces quatre espèces. Cependant, le gène clé JAR4, qui convertit l'acide jasmonique (JA) en sa forme biologiquement active, le JA-Ile, a vu son niveau de transcription s'accumuler et est très faible, notamment chez N. mills, Nepenthes pieris et N. microphylla. De plus, seul le transcrit du gène AOS n'a pas été détecté chez N. bifidum. Ces variations d'expression génique pourraient expliquer les phénotypes extrêmes induits par la faible production de JA chez les espèces anergiques et l'induction observée chez N. gracilis.
(A) Analyse, par la théorie de l'information, de la reprogrammation des réponses transcriptionnelles précoces de quatre espèces de tabac étroitement apparentées, échantillonnées 30 minutes après l'induction de l'herbivorie. L'indice RDPI est calculé en comparant les feuilles induites par l'herbivore OS avec le témoin (blessure). Les couleurs indiquent les différentes espèces et les symboles, les différents traitements. (B) Analyse de l'expression génique dans les voies de signalisation de l'acide jasmonique (JA) chez les quatre espèces. Le schéma simplifié de la voie JA est présenté à côté du diagramme en boîte. Les différentes couleurs indiquent les différents traitements. L'astérisque indique une différence significative entre le traitement W + OS et le témoin W + W (test t de Student pour les différences deux à deux : *P < 0,05, **P < 0,01 et ***P < 0,001). OPDA : acide 12-oxophytodiénoïque ; OPC-8 : acide 0,3-oxo-2-(2′(Z)-pentényl)-cyclopentane-1-octanoïque.
Dans la dernière partie, nous avons étudié comment le remodelage spécifique du métabolome de différentes espèces végétales par les insectes peut conférer une résistance aux herbivores. Des recherches antérieures ont porté sur le genre Nicotiana. Leur résistance aux mycorhizes et aux larves varie considérablement (40). Ici, nous avons étudié le lien entre ce modèle et leur plasticité métabolique. En utilisant les quatre espèces de tabac mentionnées précédemment et en testant la corrélation entre la diversité et la spécialisation du métabolome induites par les herbivores et la résistance des plantes aux mycorhizes et aux larves, nous avons constaté que la résistance, la diversité et la spécialisation face à l'insecte généraliste Larve sont toutes positivement corrélées, tandis que la corrélation entre la résistance aux larves expertes et la spécialisation est faible, et la corrélation avec la diversité n'est pas significative (Figure S10). Concernant la résistance à Larve, les espèces atténuées N. chinensis et N. gracilis, dont il a été précédemment démontré qu'elles présentaient à la fois des niveaux de transduction du signal JA et une plasticité du métabolome, ont montré des réponses très différentes à l'induction par les herbivores, tout en présentant une résistance élevée similaire.
Au cours des soixante dernières années, la théorie de la défense des plantes a fourni un cadre théorique permettant aux chercheurs de prédire un nombre considérable d'évolutions et de fonctions des métabolites spécialisés des plantes. La plupart de ces théories ne suivent pas la procédure habituelle d'inférences fortes (41). Elles proposent des prédictions clés (3) au même niveau d'analyse. Lorsque la vérification des prédictions clés permet d'analyser des théories spécifiques, certaines sont validées, d'autres rejetées (42). Au contraire, la nouvelle théorie formule des prédictions à différents niveaux d'analyse et ajoute une nouvelle dimension descriptive (42). Cependant, les deux théories proposées au niveau fonctionnel, MT et OD, peuvent être facilement interprétées comme des prédictions importantes des changements métaboliques spécialisés induits par les herbivores : la théorie OD postule que les changements dans l'« espace » métabolique spécialisé sont fortement directionnels. La théorie MT, quant à elle, postule que ces changements sont non directionnels et répartis aléatoirement dans l'espace métabolique, et tendent à impliquer des métabolites à forte valeur de défense. Les analyses précédentes des prédictions OD et MT ont été réalisées à l'aide d'un ensemble restreint de composés de « défense » prédéfinis. Ces tests centrés sur les métabolites empêchent d'analyser l'étendue et la trajectoire de la reconfiguration du métabolome lors de l'herbivorie, et ne permettent pas de réaliser des tests dans un cadre statistique cohérent pour formuler des prédictions clés pouvant être considérées comme globales. Quantifier les changements du métabolome végétal. Ici, nous avons utilisé une technologie innovante en métabolomique basée sur la spectrométrie de masse computationnelle et effectué une analyse de déconvolution par spectrométrie de masse dans le cadre général des descripteurs de la théorie de l'information pour tester la distinction entre les deux modèles proposés au niveau global de la métabolomique. La prédiction clé de cette théorie. La théorie de l'information a été appliquée dans de nombreux domaines, notamment dans le contexte de la recherche sur la biodiversité et les flux de nutriments (43). Cependant, à notre connaissance, il s'agit de la première application utilisée pour décrire l'espace d'information métabolique des plantes et résoudre des problèmes écologiques liés aux changements métaboliques temporaires en réponse à des signaux environnementaux. En particulier, la force de cette méthode réside dans sa capacité à comparer les modèles au sein et entre les espèces végétales pour examiner comment les herbivores ont évolué de différentes espèces aux modèles macroévolutifs interspécifiques à différents niveaux d'évolution. Métabolisme.
L'analyse en composantes principales (ACP) transforme un ensemble de données multivariées en un espace de dimensionnalité réduite afin d'expliquer la tendance principale des données. Elle est donc couramment utilisée comme technique exploratoire pour analyser les données, notamment pour la déconvolution du métabolome. Cependant, la réduction de dimensionnalité entraîne une perte d'information et l'ACP ne fournit pas d'informations quantitatives sur des caractéristiques particulièrement pertinentes pour la théorie écologique, telles que : comment les herbivores modifient-ils la diversité des métabolites dans des domaines spécialisés (par exemple, la richesse, la distribution et l'abondance) ? Quels métabolites prédisent l'état induit d'un herbivore donné ? Du point de vue de la spécificité, de la diversité et de l'inductibilité, le contenu informationnel du profil métabolique spécifique aux feuilles est décomposé, révélant que la consommation d'herbivores peut activer des métabolismes spécifiques. De manière inattendue, nous avons observé que, comme décrit par les indicateurs de la théorie de l'information mis en œuvre, la situation métabolique résultante présente un fort chevauchement après les attaques des deux herbivores (le généraliste nocturne Sl et l'expert en Solanacées Ms), bien que leur comportement alimentaire et leur concentration soient significativement différents. L'initiateur du conjugué acide gras-acide aminé (FAC) dans OS (31) a été identifié. En utilisant l'herbivore OS pour traiter des plaies de piqûre standardisées, le traitement simulé par herbivore a également montré une tendance similaire. Cette procédure standardisée de simulation de la réponse des plantes aux attaques d'herbivores élimine les facteurs de confusion causés par les changements de comportement alimentaire des herbivores, qui entraînent des degrés de dommages variables à différents moments (34). Le FAC, connu pour être la principale cause d'OSM, réduit les réponses de JAS et d'autres hormones végétales dans OSS1, tandis qu'OSS1 les réduit des centaines de fois (31). Cependant, OSS1 a provoqué des niveaux d'accumulation de JA similaires à ceux d'OSM. Il a été démontré précédemment que la réponse JA chez les Nepenthes atténuées est très sensible à l'OSM, le FAC conservant son activité même dilué au 1/1000 dans l'eau (44). Par conséquent, comparativement à l'OSM, bien que la concentration de FAC dans OSS1 soit très faible, elle suffit à induire une production importante de JA. Des études antérieures ont montré que les protéines de type porine (45) et les oligosaccharides (46) peuvent servir de signaux moléculaires pour déclencher les réponses de défense des plantes chez OSS1. Cependant, le rôle de ces éliciteurs dans l'accumulation de JA observée dans la présente étude reste à déterminer.
Bien que peu d'études décrivent les profils métaboliques différentiels induits par l'application de différents herbivores ou par l'apport exogène d'acide jasmonique (JA) ou d'acide salicylique (SA) (47), aucune n'a étudié de manière systématique la perturbation spécifique à l'espèce d'herbivore au sein du réseau métabolique de la plante et ses effets sur le métabolisme. L'impact global sur le métabolisme est étudié de façon systématique. Cette analyse a confirmé que la connexion du réseau hormonal interne avec d'autres hormones végétales que les JA influence la spécificité de la réorganisation métabolique induite par les herbivores. En particulier, nous avons observé que l'ET induite par OSM était significativement supérieure à celle induite par OSS1. Ce résultat est cohérent avec une teneur plus élevée en FAC chez OSM, condition nécessaire et suffisante pour déclencher une forte production d'ET (48). Dans le contexte de l'interaction entre les plantes et les herbivores, la fonction de signalisation de l'ET sur la dynamique des métabolites spécifiques aux plantes reste sporadique et ne cible qu'un seul groupe de composés. De plus, la plupart des études ont utilisé l'application exogène d'ET, de ses précurseurs ou de divers inhibiteurs pour étudier sa régulation. Or, ces applications chimiques exogènes entraînent de nombreux effets secondaires non spécifiques. À notre connaissance, cette étude représente le premier examen systématique à grande échelle du rôle de l'ET dans la production et la perception de plantes transgéniques altérées, afin de coordonner la dynamique du métabolome végétal. L'induction de l'ET spécifique aux herbivores peut moduler la réponse du métabolome. Le résultat le plus significatif est la manipulation transgénique des gènes de biosynthèse (ACO) et de perception (ETR1) de l'ET, qui a révélé l'accumulation de novo de phénolamides spécifique aux herbivores. Il a été précédemment démontré que l'ET peut moduler finement l'accumulation de nicotine induite par l'acide jasmonique (JA) en régulant la putrescine N-méthyltransférase (49). Cependant, d'un point de vue mécanistique, le mécanisme par lequel l'ET module finement l'induction des phénamides reste obscur. Outre sa fonction de transduction du signal, l'ET peut également orienter le flux métabolique vers la S-adénosyl-1-méthionine afin de réguler la synthèse des polyaminophénolamides. La S-adénosyl-1-méthionine est un intermédiaire commun de l'ET et de la voie de biosynthèse des polyamines. Le mécanisme par lequel le signal de l'ET régule le taux de phénolamide nécessite des études complémentaires.
Pendant longtemps, en raison du grand nombre de métabolites spécifiques de structure inconnue, l'attention portée à des catégories métaboliques particulières n'a pas permis d'évaluer précisément l'évolution temporelle de la diversité métabolique après des interactions biologiques. Actuellement, l'analyse par la théorie de l'information révèle que l'acquisition de spectres MS/MS à partir de métabolites non biaisés montre que les herbivores, qu'ils consomment ou simulent des herbivores, réduisent la diversité métabolique globale du métabolome foliaire tout en augmentant son degré de spécialisation. Cette augmentation temporaire de la spécificité du métabolome, induite par les herbivores, est associée à une augmentation synergique de la spécificité du transcriptome. Le métabolite spécifique dont la fonction herbivore a été préalablement caractérisée est celui qui contribue le plus à cette spécialisation accrue du métabolome. Ce modèle est cohérent avec les prédictions de la théorie de l'orientation (OD), mais pas avec celles de la théorie de la modulation (MT) relatives au caractère aléatoire de la reprogrammation du métabolome. Cependant, ces données sont également cohérentes avec la prédiction du modèle mixte (meilleur MT ; Figure 1B), car d'autres métabolites non caractérisés avec des fonctions de défense inconnues peuvent encore suivre une distribution aléatoire de Si.
Une tendance notable mise en évidence par cette recherche est que, du niveau de la micro-évolution (plante isolée et population de tabac) à une échelle évolutive plus large (espèces de tabac étroitement apparentées), différents niveaux d'organisation évolutive sont en situation de « meilleure défense ». Il existe des différences significatives dans les capacités des herbivores. Moore et al. (20) et Kessler et Kalske (1) ont proposé indépendamment de convertir les trois niveaux fonctionnels de biodiversité initialement distingués par Whittaker (50) en changements temporels constitutifs et induits de la diversité chimique ; ces auteurs n'ont cependant pas synthétisé les procédures de collecte de données métabolomiques à grande échelle et n'ont pas non plus précisé comment calculer la diversité métabolique à partir de ces données. Dans cette étude, des ajustements mineurs à la classification fonctionnelle de Whittaker considèrent la diversité métabolique α comme la diversité des spectres MS/MS d'une plante donnée, la diversité métabolique β comme le métabolisme intraspécifique de base d'un groupe de populations, et la diversité métabolique γ comme une extension de l'analyse d'espèces similaires.
Le signal JA est essentiel à de nombreuses réponses métaboliques des herbivores. Cependant, la contribution de la régulation intraspécifique de la biosynthèse du JA à la diversité du métabolome reste mal évaluée quantitativement, et le rôle du signal JA comme site général de diversification métabolique induite par le stress à une échelle macroévolutive supérieure demeure incertain. Nous avons observé que le régime herbivore des Nepenthes herbivores induit une spécialisation du métabolome, et que la variation de cette spécialisation au sein des populations de Nicotiana et entre espèces apparentées est systématiquement corrélée positivement avec la signalisation JA. De plus, en cas d'altération du signal JA, la spécificité métabolique induite par un herbivore de génotype unique est annulée (Figure 3, C et E). Étant donné que les modifications du spectre métabolique des populations de Nepenthes naturellement atténuées sont principalement quantitatives, les variations de la diversité et de la spécificité métaboliques (β) observées dans cette analyse pourraient être largement dues à la forte stimulation de catégories de composés riches en métabolites. Ces classes de composés dominent une partie du profil métabolomique et sont positivement corrélées aux signaux JA.
Étant donné que les mécanismes biochimiques des espèces de tabac étroitement apparentées sont très différents, l'identification des métabolites repose spécifiquement sur une approche qualitative, ce qui confère à l'analyse une dimension plus analytique. Le traitement du profil métabolique obtenu par la théorie de l'information révèle que l'induction par les herbivores exacerbe le compromis entre la diversité métabolique gamma et la spécialisation. Le signal JA joue un rôle central dans ce compromis. L'augmentation de la spécialisation du métabolome est cohérente avec la principale prédiction de la diversité évolutive (DO) et est positivement corrélée au signal JA, tandis que ce dernier est négativement corrélé à la diversité métabolique gamma. Ces modèles indiquent que la capacité de DO des plantes est principalement déterminée par la plasticité du JA, que ce soit à l'échelle microévolutive ou à une échelle évolutive plus large. Des expériences d'application exogène de JA, qui contournent les défauts de biosynthèse de ce composé, révèlent en outre que les espèces de tabac étroitement apparentées peuvent être distinguées en espèces sensibles et insensibles au signal, en fonction de leur mode de plasticité du JA et de leur métabolome induite par les herbivores. Les espèces insensibles au signal ne peuvent y répondre en raison de leur incapacité à produire du JA endogène et sont donc soumises à des limitations physiologiques. Cela pourrait être dû à des mutations de certains gènes clés de la voie de signalisation JA (AOS et JAR4 chez N. crescens). Ce résultat souligne que ces schémas macroévolutifs interspécifiques pourraient être principalement déterminés par des changements dans la perception et la sensibilité aux hormones internes.
Outre l'interaction entre les plantes et les herbivores, l'exploration de la diversité métabolique est liée à toutes les avancées théoriques majeures dans la recherche sur l'adaptation biologique à l'environnement et l'évolution des caractères phénotypiques complexes. Grâce à l'augmentation du volume de données acquises par les spectromètres de masse modernes, les tests d'hypothèses sur la diversité métabolique peuvent désormais dépasser les différences individuelles ou catégorielles de métabolites et réaliser une analyse globale révélant des schémas inattendus. Dans le cadre d'analyses à grande échelle, une métaphore importante consiste à concevoir des cartes pertinentes pour explorer les données. Ainsi, un résultat important de la combinaison actuelle de la métabolomique MS/MS non biaisée et de la théorie de l'information est qu'elle fournit une métrique simple permettant de construire des cartes pour explorer la diversité métabolique à différentes échelles taxonomiques. C'est la condition essentielle de cette méthode pour l'étude de la micro/macroévolution et de l'écologie des communautés.
Au niveau macro-évolutif, le cœur de la théorie de la coévolution plantes-insectes d'Ehrlich et Raven (51) repose sur l'hypothèse que la variation de la diversité métabolique interspécifique est à l'origine de la diversification des lignées végétales. Cependant, cinquante ans après la publication de cet ouvrage fondateur, cette hypothèse a rarement été testée (52). Ceci est principalement dû aux caractéristiques phylogénétiques des métabolites comparables au sein de lignées végétales éloignées. Cette rareté peut servir de point d'ancrage aux méthodes d'analyse ciblées. Le flux de travail MS/MS actuel, basé sur la théorie de l'information, quantifie la similarité structurale MS/MS de métabolites inconnus (sans sélection préalable de métabolites) et convertit ces spectres MS/MS en un ensemble de spectres MS/MS, permettant ainsi, dans le cadre d'une analyse métabolique professionnelle, la comparaison de ces modèles macro-évolutifs sur une échelle de classification. Des indicateurs statistiques simples sont utilisés. Le processus est similaire à l'analyse phylogénétique, qui peut utiliser l'alignement de séquences pour quantifier le taux de diversification ou d'évolution des caractères sans prédiction préalable.
Au niveau biochimique, l'hypothèse de sélection de Firn et Jones (53) montre que la diversité métabolique est maintenue à différents niveaux afin de fournir les matières premières nécessaires à l'activité biologique de métabolites auparavant non apparentés ou substitués. Les méthodes de la théorie de l'information offrent un cadre permettant de quantifier ces transitions évolutives spécifiques aux métabolites, qui surviennent lors de la spécialisation métabolique, dans le cadre du processus de sélection évolutive proposé : adaptation biologiquement active d'une faible spécificité à une forte spécificité ; métabolites inhibés dans un environnement donné.
En résumé, aux débuts de la biologie moléculaire, d'importantes théories de défense des plantes ont été élaborées, et les méthodes déductives, fondées sur des hypothèses, sont largement considérées comme le seul moyen de progrès scientifique. Ceci est dû en grande partie aux limitations techniques de la mesure du métabolome complet. Bien que ces méthodes soient particulièrement utiles pour identifier d'autres mécanismes causaux, leur capacité à faire progresser notre compréhension des réseaux biochimiques est plus limitée que celle des méthodes informatiques actuellement disponibles dans les sciences des données contemporaines. Par conséquent, les théories imprévisibles dépassent largement le cadre des données disponibles, et le cycle de validation/test hypothétique, essentiel au progrès dans ce domaine de recherche, ne peut être aboli (4). Nous pensons que le flux de travail informatique de la métabolomique présenté ici peut raviver l'intérêt pour les questions récentes (comment) et finales (pourquoi) de la diversité métabolique, et contribuer à une nouvelle ère de science des données guidée par la théorie. Cette ère a permis de réexaminer les théories importantes qui ont inspiré les générations précédentes.
L’alimentation directe des herbivores est réalisée en élevant une larve de deuxième stade (ou larve S1) sur une seule feuille pâle d’une plante carnivore (Sarracénia officinal) d’un rosier en fleurs, avec 10 répétitions par plante. Les larves d’insectes sont fixées à l’aide de pinces, et le tissu foliaire restant est prélevé 24 et 72 heures après l’infection, puis congelé rapidement. Les métabolites sont ensuite extraits.
Simuler un traitement par herbivores de manière très synchronisée. La méthode consiste à utiliser des roues à motifs textiles pour perforer trois rangées d'épines de chaque côté de la nervure centrale des trois feuilles complètement développées de la plante, pendant la phase de croissance de la guirlande textile, et appliquer immédiatement une solution diluée à 1:5. Ou bien, utiliser des doigts gantés pour insérer S1 OS dans la perforation. Récolter et traiter une feuille comme décrit précédemment. Utiliser la méthode décrite précédemment pour extraire les métabolites primaires et les hormones végétales (54).
Pour les applications exogènes d'acide jasmonique (JA), les trois feuilles du pétiole de six rosiers en fleurs de chaque espèce sont traitées avec 20 µl de pâte de lanoline contenant 150 µg de méthyl-JA (Lan + MeJA), ou avec 20 µl de lanoline additionnée d'un traitement de plaie (Lan + W), ou encore avec 20 µl de lanoline pure comme témoin. Les feuilles sont récoltées 72 heures après le traitement, congelées instantanément dans l'azote liquide et conservées à -80 °C jusqu'à leur utilisation.
Quatre lignées transgéniques JA et ET, à savoir irAOC (36), irCOI1 (55), irACO et sETR1 (48), ont été identifiées au sein de notre équipe de recherche. La lignée irAOC a montré une forte diminution des taux de JA et de JA-Ile, tandis que la lignée irCOI1 était insensible aux JA. Comparée au témoin (EV), l'accumulation de JA-Ile était augmentée. De même, la lignée irACO réduisait la production d'ET, et, comparativement au témoin (EV), la lignée sETR1, insensible à l'ET, augmentait la production d'ET.
Un spectromètre laser photoacoustique (capteur d'ET en temps réel Sensor Sense ETD-300) est utilisé pour mesurer l'ET de manière non invasive. Immédiatement après le traitement, la moitié des feuilles est prélevée et transférée dans un flacon en verre scellé de 4 ml. L'espace de tête est laissé à s'accumuler pendant 5 heures. Durant la mesure, chaque flacon est purgé pendant 8 minutes avec un flux d'air pur de 2 litres/heure, préalablement filtré sur un catalyseur fourni par Sensor Sense pour éliminer le CO₂ et l'eau.
Les données de la puce à ADN ont été initialement publiées dans (35) et enregistrées dans la base de données complète d'expression génique du NCBI (numéro d'accès GSE30287). Les données correspondant aux feuilles traitées avec W + OSMs et au témoin non endommagé ont été extraites pour cette étude. L'intensité brute est exprimée en log2. Avant l'analyse statistique, la valeur de base a été convertie et normalisée à son 75e percentile à l'aide du logiciel R.
Les données originales de séquençage d'ARN (RNA-seq) des espèces de Nicotiana ont été extraites des archives de lecture courte (SRA) du NCBI (numéro de projet PRJNA301787), décrites par Zhou et al. (39) et traitées selon la méthode décrite dans (56). Les données brutes traitées par W+W, W+OSM et W+OSS1 correspondant aux espèces de Nicotiana ont été sélectionnées pour cette étude et traitées comme suit : les lectures RNA-seq brutes ont d'abord été converties au format FASTQ. HISAT2 a ensuite converti les fichiers FASTQ en SAM, puis SAMtools a converti les fichiers SAM en fichiers BAM triés. L'expression génique a été calculée avec StringTie, selon la méthode d'expression exprimée en nombre de fragments par millier de bases et par million de fragments de transcription séquencés.
La colonne chromatographique Acclaim (150 mm × 2,1 mm ; granulométrie 2,2 µm) utilisée pour l’analyse et la colonne de garde (4 mm × 4 mm) sont constituées du même matériau. Le gradient binaire suivant est utilisé dans le système de chromatographie liquide ultra-performante (UHPLC) Dionex UltiMate 3000 : de 0 à 0,5 minute, phase isocratique à 90 % A [eau désionisée, 0,1 % (v/v) d’acétonitrile et 0,05 % d’acide formique] et 10 % B (acétonitrile et 0,05 % d’acide formique) ; de 0,5 à 23,5 minutes, phase de gradient à 10 % A et 90 % B ; de 23,5 à 25 minutes, phase isocratique à 10 % A et 90 % B. Le débit est de 400 µl/min. Pour toutes les analyses MS, injectez l'éluant de la colonne dans un analyseur quadripolaire et temps de vol (qTOF) équipé d'une source d'électrospray fonctionnant en mode d'ionisation positive (tension capillaire, 4500 V ; sortie capillaire 130 V ; température de séchage 200 °C ; débit d'air de séchage 10 litres/min).
Effectuez une analyse de fragments MS/MS (ci-après dénommée MS/MS) non pertinente ou indiscernable des données afin d'obtenir des informations structurales sur le profil métabolique global détectable. Le principe de la méthode MS/MS non discriminante repose sur la très large fenêtre d'isolation de masse du quadripôle [considérez donc tous les signaux de rapport masse/charge (m/z) comme des fragments]. L'instrument Impact II n'ayant pas permis de générer une inclinaison CE, plusieurs analyses indépendantes ont été réalisées avec des valeurs d'énergie de collision (CE) de dissociation induite par collision (CID) accrues. En résumé, analysez d'abord l'échantillon par UHPLC-ionisation par électrospray/qTOF-MS en mode de spectrométrie de masse unique (faible fragmentation générée par fragmentation en source), en balayant de m/z 50 à 1500 à une fréquence de répétition de 5 Hz. Utilisez l'azote comme gaz de collision pour l'analyse MS/MS et effectuez des mesures indépendantes aux quatre tensions de dissociation induite par collision suivantes : 20, 30, 40 et 50 eV. Durant toute la mesure, le quadripôle présente la plus grande fenêtre d'isolation de masse, de m/z 50 à 1500. Lorsque le rapport m/z du corps avant et la largeur d'isolation sont réglés sur 200, la gamme de masse est automatiquement activée par le logiciel de l'instrument et initialisée à 0 Da. Recherchez les fragments de masse comme en mode de masse unique. Utilisez du formiate de sodium (50 ml d'isopropanol, 200 µl d'acide formique et 1 ml de solution aqueuse de NaOH 1 M) pour l'étalonnage de masse. À l'aide de l'algorithme d'étalonnage haute précision de Bruker, le fichier de données est étalonné après l'acquisition du spectre moyen sur une période donnée. Utilisez la fonction d'exportation du logiciel Data Analysis v4.0 (Brook Dalton, Brême, Allemagne) pour convertir les fichiers de données brutes au format NetCDF. L'ensemble de données MS/MS a été enregistré dans la base de données métabolomiques ouverte MetaboLights (www.ebi.ac.uk) sous le numéro d'accès MTBLS1471.
L'assemblage MS/MS peut être réalisé grâce à une analyse de corrélation entre les signaux de qualité MS1 et MS/MS pour les énergies de collision basses et hautes, et selon de nouvelles règles implémentées. Un script R est utilisé pour réaliser l'analyse de corrélation de la distribution du précurseur au produit, et un script C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) est utilisé pour implémenter les règles.
Afin de réduire les faux positifs dus au bruit de fond et les fausses corrélations causées par la détection de certaines caractéristiques m/z dans un nombre limité d'échantillons, nous utilisons la fonction « filled peak » du package R XCMS (pour la correction du bruit de fond). Cette fonction remplace les valeurs d'intensité « NA » (pics non détectés). Cependant, même avec la fonction « filled peak », de nombreuses valeurs d'intensité nulles subsistent dans l'ensemble de données et peuvent affecter le calcul de corrélation. Nous comparons alors les résultats du traitement des données obtenus avec et sans la fonction « filled peak », puis nous calculons la valeur du bruit de fond à partir de la valeur moyenne corrigée. Enfin, nous remplaçons les valeurs nulles par cette valeur. Seules les caractéristiques dont l'intensité dépasse trois fois la valeur du bruit de fond sont considérées comme des « pics réels ». Pour les calculs de PCC, seuls les signaux m/z des précurseurs (MS1) et des fragments présentant au moins huit pics réels sont pris en compte.
Si l'intensité du signal de qualité du précurseur dans l'échantillon entier est significativement corrélée à l'intensité réduite de ce même signal soumis à une énergie de collision faible ou élevée, et si ce signal n'est pas identifié comme un pic isotopique par CAMERA, il peut être caractérisé plus précisément. Ensuite, en calculant toutes les paires précurseur-produit possibles dans un intervalle de 3 s (la fenêtre de temps de rétention estimée pour la rétention du pic), une analyse de corrélation est effectuée. Seul un fragment est considéré comme tel si sa valeur m/z est inférieure à celle du précurseur et si la fragmentation MS/MS se produit au même emplacement dans l'échantillon que le précurseur dont il est issu.
En nous basant sur ces deux règles simples, nous excluons les fragments spécifiés dont le rapport m/z est supérieur à celui du précurseur identifié, en fonction de la position du précurseur dans l'échantillon et du fragment spécifié. Il est également possible de sélectionner les caractéristiques de qualité générées par de nombreux fragments in-source produits en mode MS1 comme précurseurs candidats, générant ainsi des composés MS/MS redondants. Afin de réduire cette redondance de données, si la similarité NDP des spectres dépasse 0,6 et qu'ils appartiennent au chromatogramme « pcgroup » annoté par CAMERA, nous les fusionnons. Enfin, nous fusionnons les quatre résultats CE associés au précurseur et aux fragments dans le spectre composite déconvolué final en sélectionnant le pic d'intensité la plus élevée parmi tous les pics candidats ayant le même rapport m/z à différentes énergies de collision. Les étapes de traitement suivantes sont basées sur le concept de spectre composite et tiennent compte des différentes conditions CE nécessaires pour maximiser la probabilité de fragmentation, car certains fragments ne peuvent être détectés que sous une énergie de collision spécifique.
L'indice RDPI (30) a été utilisé pour calculer l'inductibilité du profil métabolique. La diversité du spectre métabolique (indice Hj) est dérivée de l'abondance des précurseurs MS/MS en utilisant l'entropie de Shannon de la distribution de fréquence MS/MS selon l'équation suivante décrite par Martínez et al. (8) : Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) où Pij correspond à la fréquence relative du i-ème MS/MS dans le j-ème échantillon (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
La spécificité métabolique (indice Si) est définie comme l'identité d'expression d'un spectre MS/MS donné par rapport à la fréquence des spectres des échantillons considérés. La spécificité MS/MS est calculée selon la formule Si = 1/t (∑j = 1/tPijPilog2PijPi).
Utilisez la formule suivante pour mesurer l'indice δj spécifique au métabolome de chaque échantillon j, et la spécificité moyenne MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
Les spectres MS/MS sont alignés par paires, et la similarité est calculée à partir de deux scores. Premièrement, en utilisant la méthode NDP standard (également connue sous le nom de méthode de corrélation cosinus), on calcule la similarité des segments entre les spectres selon l'équation suivante : NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2, où S1 et S2 représentent respectivement les spectres 1 et 2, ainsi que WS1, i et WS2. i représente le poids basé sur l'intensité du pic, la différence d'intensité du i-ème pic commun entre les deux spectres étant inférieure à 0,01 Da. Le poids est calculé comme suit : W = [intensité du pic] m [qualité] n, avec m = 0,5 et n = 2, conformément aux recommandations de MassBank.
Une seconde méthode de notation a été mise en œuvre, consistant à analyser les listes de noms de domaine (NL) partagées entre les spectres MS/MS. À cette fin, nous avons utilisé conjointement les 52 listes de NL fréquemment rencontrées lors de la fragmentation MS et les NL plus spécifiques (fichier de données S1) précédemment annotées pour le spectre MS/MS des métabolites secondaires des espèces de Nepenthes affaiblies (9, 26). Un vecteur binaire de 1 et 0 a été créé pour chaque spectre MS/MS, correspondant respectivement à la présence et à l'absence de certains NL. Le score de similarité des NL a ensuite été calculé pour chaque paire de vecteurs binaires de NL, sur la base de la distance euclidienne.
Pour réaliser le clustering binaire, nous avons utilisé le package R DiffCoEx, basé sur une extension de l'analyse de co-expression génique pondérée (WGCNA). À partir des matrices de scores NDP et NL des spectres MS/MS, nous avons utilisé DiffCoEx pour calculer la matrice de corrélation comparative. Le clustering binaire a été effectué en paramétrant le paramètre « cutreeDynamic » avec les valeurs suivantes : method = « hybrid », cutHeight = 0,9999, deepSplit = T et minClusterSize = 10. Le code source R de DiffCoEx a été téléchargé à partir du fichier supplémentaire 1 de Tesson et al. (57). Le package logiciel R WGCNA requis est disponible à l'adresse suivante : https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Afin d'effectuer une analyse de réseau moléculaire MS/MS, nous avons calculé la connectivité spectrale appariée en fonction des types de similarité NDP et NL, et utilisé le logiciel Cytoscape pour visualiser la topologie du réseau à l'aide d'une disposition organique dans l'application d'extension d'algorithme de disposition CyFilescape yFiles.
Utilisez le logiciel R (version 3.0.1) pour réaliser l'analyse statistique des données. La significativité statistique a été évaluée par une analyse de variance à deux facteurs (ANOVA), suivie du test post-hoc de Tukey (HSD). Afin d'analyser la différence entre le traitement avec herbivores et le groupe témoin, la distribution bilatérale des deux groupes d'échantillons, présentant la même variance, a été analysée par un test t de Student.
Pour consulter les documents complémentaires relatifs à cet article, veuillez vous rendre à l'adresse suivante : http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
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La théorie de l'information fournit une monnaie universelle pour la comparaison de métabolomes spécifiques et la prédiction des théories de défense aux tests.
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