Cet article fait partie du thème de recherche « Amélioration de la résistance des légumineuses aux pathogènes et aux ravageurs ». Voir les 5 articles.
L'agent causal de la nécrose fongique des plantes, *Sclerotinia sclerotiorum* (Lib.) de Bary, utilise une stratégie à plusieurs niveaux pour infecter différentes plantes hôtes. Cette étude propose l'utilisation de la L-ornithine, une diamine qui stimule la synthèse d'autres acides aminés essentiels, comme stratégie de gestion alternative pour améliorer les réponses moléculaires, physiologiques et biochimiques de *Phaseolus vulgaris* L. à la pourriture blanche causée par *Pseudomonas sclerotiorum*. Des expériences *in vitro* ont montré que la L-ornithine inhibait significativement la croissance mycélienne de *S. pyrenoidosa* de manière dose-dépendante. De plus, elle réduisait significativement la gravité de la pourriture blanche en serre. Enfin, la L-ornithine stimulait la croissance des plantes traitées, indiquant que les concentrations testées n'étaient pas phytotoxiques. De plus, la L-ornithine a stimulé l'expression des antioxydants non enzymatiques (phénols solubles totaux et flavonoïdes) et enzymatiques (catalase (CAT), peroxydase (POX) et polyphénol oxydase (PPO)), et a augmenté l'expression de trois gènes liés aux antioxydants (PvCAT1, PvSOD et PvGR). Par ailleurs, l'analyse bioinformatique a révélé la présence d'une protéine putative d'oxaloacétate acétylhydrolase (SsOAH) dans le génome de S. sclerotiorum, présentant une forte similarité avec les protéines d'oxaloacétate acétylhydrolase (SsOAH) d'Aspergillus fijiensis (AfOAH) et de Penicillium sp. (PlOAH) en termes d'analyse fonctionnelle, de domaines conservés et de topologie. Il est intéressant de noter que l'ajout de L-ornithine au milieu de culture PDB (bouillon de dextrose de pomme de terre) a significativement diminué l'expression du gène SsOAH dans le mycélium de S. sclerotiorum. De même, l'application exogène de L-ornithine a significativement diminué l'expression du gène SsOAH dans le mycélium fongique prélevé sur les plantes traitées. Enfin, l'application de L-ornithine a significativement diminué la sécrétion d'acide oxalique à la fois dans le milieu PDB et dans les feuilles infectées. En conclusion, la L-ornithine joue un rôle clé dans le maintien du statut redox et le renforcement des mécanismes de défense des plantes infectées. Les résultats de cette étude pourraient contribuer au développement de méthodes innovantes et respectueuses de l'environnement pour lutter contre la pourriture blanche et atténuer son impact sur la production de haricots et d'autres cultures.
La pourriture blanche, causée par le champignon nécrotrophe Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, est une maladie dévastatrice qui réduit considérablement les rendements et constitue une menace sérieuse pour la production mondiale de haricot (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum est l'un des champignons phytopathogènes telluriques les plus difficiles à contrôler. Il s'attaque à plus de 600 espèces végétales et est capable de macérer rapidement et de manière non spécifique les tissus de ses hôtes (Liang et Rollins, 2018). Dans des conditions défavorables, il traverse une phase critique de son cycle de vie, restant dormant pendant de longues périodes sous forme de structures noires, dures et ressemblant à des graines, appelées « sclérotes », dans le sol, ou sous forme d'excroissances blanches et duveteuses dans le mycélium ou la moelle de la tige des plantes infectées (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum est capable de former des sclérotes, ce qui lui permet de survivre longtemps dans les champs infectés et de persister durant la maladie (Schwartz et al., 2005). Riches en nutriments, les sclérotes peuvent persister longtemps dans le sol et constituent l'inoculum primaire pour les infections ultérieures (Schwartz et al., 2005). Dans des conditions favorables, les sclérotes germent et produisent des spores aéroportées qui peuvent infecter toutes les parties aériennes de la plante, notamment les fleurs, les tiges et les gousses (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum utilise une stratégie à plusieurs niveaux pour infecter ses plantes hôtes, impliquant une série d'événements coordonnés, de la germination des sclérotes à l'apparition des symptômes. Initialement, S. sclerotiorum produit des spores en suspension (appelées ascospores) à partir de structures fongiques appelées apothécies. Ces spores se dispersent dans l'air et se développent en sclérotes immobiles sur les débris végétaux infectés (Bolton et al., 2006). Le champignon sécrète ensuite de l'acide oxalique, un facteur de virulence, afin de contrôler le pH de la paroi cellulaire végétale, de favoriser la dégradation enzymatique et l'invasion tissulaire (Hegedus et Rimmer, 2005), et de supprimer le stress oxydatif de la plante hôte. Ce processus d'acidification fragilise la paroi cellulaire végétale, créant un environnement favorable au fonctionnement normal et efficace des enzymes fongiques de dégradation de la paroi cellulaire (EDPC), permettant ainsi au pathogène de franchir la barrière physique et de pénétrer dans les tissus de l'hôte (Marciano et al., 1983). Une fois pénétré, S. sclerotiorum sécrète plusieurs enzymes de dégradation de l'eau (CWDE), telles que la polygalacturonase et la cellulase, qui facilitent sa dissémination dans les tissus infectés et provoquent une nécrose tissulaire. La progression des lésions et des mycéliums conduit aux symptômes caractéristiques de la pourriture blanche (Hegedus et Rimmer, 2005). Parallèlement, les plantes hôtes reconnaissent les motifs moléculaires associés aux pathogènes (PAMP) grâce à des récepteurs de reconnaissance de motifs (PRR), déclenchant une cascade de signalisation qui active finalement les réponses de défense.
Malgré des décennies d'efforts de lutte contre les maladies, le haricot, comme d'autres cultures commerciales, souffre toujours d'une pénurie de matériel génétique résistant adéquat, en raison de la résistance, de la survie et de l'adaptabilité du pathogène. La gestion de cette maladie est donc extrêmement complexe et exige une stratégie intégrée et multifactorielle combinant pratiques culturales, lutte biologique et fongicides chimiques (O'Sullivan et al., 2021). La lutte chimique contre la sclérotiniose est la plus efficace car les fongicides, appliqués correctement et au bon moment, permettent de contrôler efficacement la propagation de la maladie, de réduire la gravité de l'infection et de minimiser les pertes de rendement. Cependant, leur utilisation excessive et la dépendance excessive à leur égard peuvent entraîner l'émergence de souches résistantes de Sclerotinia sclerotiorum et avoir un impact négatif sur les organismes non ciblés, la santé des sols et la qualité de l'eau (Le Cointe et al., 2016 ; Ceresini et al., 2024). Par conséquent, la recherche d'alternatives respectueuses de l'environnement est devenue une priorité absolue.
Les polyamines (PA), telles que la putrescine, la spermidine, la spermine et la cadavérine, peuvent constituer des alternatives prometteuses contre les pathogènes telluriques des plantes, permettant ainsi de réduire, totalement ou partiellement, l'utilisation de fongicides chimiques dangereux (Nehela et al., 2024 ; Yi et al., 2024). Chez les plantes supérieures, les PA interviennent dans de nombreux processus physiologiques, notamment la division cellulaire, la différenciation et la réponse aux stress abiotiques et biotiques (Killiny et Nehela, 2020). Ils peuvent agir comme antioxydants, contribuer à l'élimination des espèces réactives de l'oxygène (ERO), maintenir l'homéostasie redox (Nehela et Killiny, 2023), induire l'expression de gènes de défense (Romero et al., 2018), réguler diverses voies métaboliques (Nehela et Killiny, 2023), moduler les phytohormones endogènes (Nehela et Killiny, 2019), établir une résistance systémique acquise (RSA) et réguler les interactions plante-pathogène (Nehela et Killiny, 2020 ; Asija et al., 2022 ; Czerwoniec, 2022). Il est important de noter que les mécanismes et les rôles spécifiques des polyamines (PA) dans la défense des plantes varient selon les espèces végétales, les pathogènes et les conditions environnementales. La PA la plus abondante chez les plantes est biosynthétisée à partir de la L-ornithine, une polyamine essentielle (Killiny et Nehela, 2020).
La L-ornithine joue de multiples rôles dans la croissance et le développement des plantes. Par exemple, des études antérieures ont montré que chez le riz (Oryza sativa), l'ornithine pourrait être associée au recyclage de l'azote (Liu et al., 2018), au rendement, à la qualité et à l'arôme du riz (Lu et al., 2020), ainsi qu'à la réponse au stress hydrique (Yang et al., 2000). De plus, l'application exogène de L-ornithine a significativement amélioré la tolérance à la sécheresse chez la betterave sucrière (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) et atténué le stress salin chez l'oignon (Allium cepa) (Çavuşoǧlu et Çavuşoǧlu, 2021) et l'anacardier (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Le rôle potentiel de la L-ornithine dans la défense contre les stress abiotiques pourrait être dû à son implication dans l'accumulation de proline chez les plantes traitées. Par exemple, il a été démontré que des gènes liés au métabolisme de la proline, tels que les gènes de l'ornithine delta-aminotransférase (delta-OAT) et de la proline déshydrogénase (ProDH1 et ProDH2), participent à la défense de Nicotiana benthamiana et d'Arabidopsis thaliana contre des souches non hôtes de Pseudomonas syringae (Senthil-Kumar et Mysore, 2012). Par ailleurs, l'ornithine décarboxylase (ODC) fongique est essentielle à la croissance des pathogènes (Singh et al., 2020). Le ciblage de l'ODC de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici par extinction génique induite par l'hôte (HIGS) a significativement amélioré la résistance des plants de tomate à la fusariose vasculaire (Singh et al., 2020). Cependant, le rôle potentiel de l'application exogène d'ornithine contre les stress biotiques, tels que les phytopathogènes, reste encore peu étudié. Plus important encore, les effets de l'ornithine sur la résistance aux maladies et les phénomènes biochimiques et physiologiques associés restent largement inexplorés.
Comprendre la complexité de l'infection des légumineuses par Sclerotinia sclerotiorum est essentiel au développement de stratégies de lutte efficaces. Cette étude visait à identifier le rôle potentiel de la diamine L-ornithine comme facteur clé du renforcement des mécanismes de défense et de la résistance des légumineuses à l'infection par Sclerotinia sclerotiorum. Nous formulons l'hypothèse que, outre le renforcement des réponses de défense des plantes infectées, la L-ornithine joue également un rôle crucial dans le maintien du statut redox. Nous proposons que les effets potentiels de la L-ornithine soient liés à la régulation des mécanismes de défense antioxydants enzymatiques et non enzymatiques, ainsi qu'à l'interaction avec les facteurs de pathogénicité/virulence du champignon et les protéines associées. Cette double fonctionnalité de la L-ornithine en fait un candidat prometteur pour une stratégie durable visant à atténuer l'impact de la pourriture blanche et à renforcer la résistance des légumineuses courantes à ce puissant pathogène fongique. Les résultats de cette étude pourraient contribuer au développement de méthodes innovantes et respectueuses de l'environnement pour lutter contre la pourriture blanche et limiter son impact sur la production de légumineuses.
Dans cette étude, une variété commerciale sensible de haricot commun, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), a été utilisée comme matériel expérimental. Des semences saines ont été aimablement fournies par le Département de recherche sur les légumineuses de l'Institut de recherche sur les grandes cultures (FCRI) du Centre de recherche agricole (ARC), en Égypte. Cinq graines ont été semées dans des pots en plastique (diamètre intérieur 35 cm, profondeur 50 cm) remplis de terreau infecté par Sclerotinia sclerotiorum, sous serre (25 ± 2 °C, humidité relative 75 ± 1 %, photopériode 8 h/16 h). Sept à dix jours après le semis, les plantules ont été éclaircies afin de ne conserver que deux plantules à croissance uniforme et à trois feuilles complètement développées dans chaque pot. Toutes les plantes en pot ont été arrosées une fois toutes les deux semaines et fertilisées mensuellement à la dose recommandée pour la variété.
Pour préparer une solution de L-ornithinediamine (également connue sous le nom d'acide (+)-(S)-2,5-diaminopentanoïque ; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Allemagne) à une concentration de 500 mg/L, 50 mg ont été dissous dans 100 mL d'eau distillée stérile. La solution mère a ensuite été diluée et utilisée pour les expériences suivantes. Six séries de concentrations de L-ornithine (12,5, 25, 50, 75, 100 et 125 mg/L) ont été testées in vitro. De l'eau distillée stérile a servi de témoin négatif (Mock) et le fongicide commercial « Rizolex-T » (poudre mouillable à 50 % de toclofos-méthyle 20 % + thirame 30 % ; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gouvernorat de Gharbia, Égypte) de témoin positif. Le fongicide commercial « Rizolex-T » a été testé in vitro à cinq concentrations (2, 4, 6, 8 et 10 mg/L).
Des échantillons de tiges et de gousses de haricot commun présentant des symptômes typiques de pourriture blanche (taux d'infestation : 10 à 30 %) ont été prélevés dans des exploitations agricoles commerciales. Bien que la plupart des échantillons infectés aient été identifiés par espèce/variété (variété commerciale sensible Giza 3), d'autres, notamment ceux provenant des marchés locaux, étaient d'espèce inconnue. Les échantillons infectés prélevés ont d'abord été désinfectés en surface avec une solution d'hypochlorite de sodium à 0,5 % pendant 3 minutes, puis rincés plusieurs fois à l'eau distillée stérile et essuyés avec du papier filtre stérile pour éliminer l'excès d'eau. Les organes infectés ont ensuite été découpés en petits fragments dans la partie médiane (entre les tissus sains et infectés), mis en culture sur milieu gélosé à la pomme de terre et au dextrose (PDA) et incubés à 25 ± 2 °C sous un cycle de 12 h de lumière/12 h d'obscurité pendant 5 jours afin de stimuler la formation de sclérotes. La méthode de prélèvement des extrémités mycéliennes a également été utilisée pour purifier les isolats fongiques issus de cultures mixtes ou contaminées. L'isolat fongique purifié a d'abord été identifié grâce à ses caractéristiques morphologiques et culturales, puis son appartenance à l'espèce *S. sclerotiorum* a été confirmée par analyse microscopique. Enfin, tous les isolats purifiés ont été testés pour leur pouvoir pathogène sur le cultivar de haricot commun sensible Giza 3, conformément aux postulats de Koch.
De plus, l'isolat de S. sclerotiorum le plus invasif (isolat n° 3) a été confirmé par séquençage de l'espaceur transcrit interne (ITS), selon la méthode décrite par White et al. (1990) et Baturo-Ciesniewska et al. (2017). Brièvement, les isolats ont été cultivés dans un bouillon de dextrose de pomme de terre (PDB) et incubés à 25 ± 2 °C pendant 5 à 7 jours. Le mycélium fongique a ensuite été récolté, filtré sur une étamine, lavé deux fois à l'eau stérile et séché sur du papier filtre stérile. L'ADN génomique a été extrait à l'aide du kit Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep (Kuramae-Izioka, 1997 ; Atallah et al., 2022, 2024). La région ITS de l'ADNr a ensuite été amplifiée à l'aide de la paire d'amorces spécifiques ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC ; taille attendue : 540 pb) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Les produits PCR purifiés ont été soumis au séquençage (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Les séquences ITS de l'ADNr ont été séquencées de manière bidirectionnelle par la méthode de Sanger. Les séquences obtenues ont ensuite été comparées aux données les plus récentes de GenBank et du National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) à l'aide du logiciel BLASTn. La séquence de requête a été comparée à 20 autres souches/isolats de *S. sclerotiorum* extraits des données les plus récentes de NCBI GenBank (Tableau supplémentaire S1) à l'aide de ClustalW dans le logiciel MEGA-11 (version 11) (Kumar et al., 2024). L'analyse évolutive a été réalisée par la méthode du maximum de vraisemblance et le modèle général de substitution nucléotidique réversible dans le temps (Nei et Kumar, 2000). L'arbre présentant la log-vraisemblance la plus élevée est présenté. L'arbre initial pour la recherche heuristique est sélectionné parmi les arbres présentant la log-vraisemblance la plus élevée : l'arbre de regroupement par la méthode des voisins (NJ) (Kumar et al., 2024) et l'arbre de parcimonie maximale (MP). L'arbre NJ a été construit à partir d'une matrice de distances par paires calculée à l'aide du modèle général réversible dans le temps (Nei et Kumar, 2000).
L'activité antibactérienne de la L-ornithine et du bactéricide « Rizolex-T » a été déterminée in vitro par la méthode de diffusion en gélose. Méthode : Prélever la quantité appropriée de la solution mère de L-ornithine (500 mg/L) et la mélanger soigneusement à 10 ml de milieu nutritif PDA afin de préparer des solutions de concentrations finales respectives de 12,5, 25, 50, 75, 100 et 125 mg/L. Cinq concentrations du fongicide « Rizolex-T » (2, 4, 6, 8 et 10 mg/L) et de l'eau distillée stérile ont été utilisées comme témoins. Après solidification du milieu, un disque de mycélium de Sclerotinia sclerotiorum fraîchement préparé, de 4 mm de diamètre, a été transféré au centre d'une boîte de Petri et cultivé à 25 ± 2 °C jusqu'à ce que le mycélium recouvre entièrement la boîte de Petri témoin. La croissance fongique a ensuite été enregistrée. Calculez le pourcentage d'inhibition de la croissance radiale de S. sclerotiorum à l'aide de l'équation 1 :
L'expérience a été répétée deux fois, avec six répétitions biologiques pour chaque groupe témoin/expérimental et cinq pots (deux plantes par pot) pour chaque répétition biologique. Chaque répétition biologique a été analysée deux fois (deux répétitions techniques) afin de garantir l'exactitude, la fiabilité et la reproductibilité des résultats expérimentaux. De plus, une analyse de régression probit a été utilisée pour calculer la concentration inhibitrice à 50 % (CI50) et la CI99 (Prentice, 1976).
Afin d'évaluer le potentiel de la L-ornithine en conditions de serre, deux expériences consécutives en pots ont été menées. Brièvement, les pots ont été remplis d'un mélange argilo-sableux stérilisé (3:1) et inoculés avec une culture fraîchement préparée de *S. sclerotiorum*. Dans un premier temps, l'isolat le plus invasif de *S. sclerotiorum* (isolat n° 3) a été cultivé en coupant un sclérote en deux, en le plaçant face contre un milieu PDA et en l'incubant à 25 °C à l'obscurité constante (24 h) pendant 4 jours afin de stimuler la croissance mycélienne. Quatre disques d'agar de 5 mm de diamètre ont ensuite été prélevés à la périphérie du sclérote et inoculés avec 100 g d'un mélange stérile de son de blé et de son de riz (1:1, v/v). Tous les flacons ont été incubés à 25 ± 2 °C sous un cycle de 12 h de lumière/12 h d'obscurité pendant 5 jours afin de stimuler la formation de sclérotes. Le contenu de chaque flacon a été soigneusement mélangé afin d'assurer son homogénéité avant l'ajout de la terre. Ensuite, 100 g du mélange de son colonisateur ont été ajoutés à chaque pot pour garantir une concentration constante de pathogènes. Les pots inoculés ont été arrosés pour activer la croissance fongique et placés en serre pendant 7 jours.
Cinq graines de la variété Giza 3 ont ensuite été semées dans chaque pot. Pour les pots traités à la L-ornithine et au fongicide Rizolex-T, les graines stérilisées ont d'abord été trempées pendant deux heures dans une solution aqueuse des deux composés, à une concentration IC99 finale d'environ 250 mg/L et 50 mg/L respectivement, puis séchées à l'air libre pendant une heure avant le semis. Les graines témoins ont été trempées dans de l'eau distillée stérile. Après 10 jours, avant le premier arrosage, les plantules ont été éclaircies afin de ne conserver que deux plantules par pot. Par ailleurs, pour garantir l'infection par S. sclerotiorum, les tiges de haricot, au même stade de développement (10 jours), ont été incisées à deux endroits différents à l'aide d'un scalpel stérilisé. Environ 0,5 g du mélange de son colonisateur a été déposé dans chaque incision, puis les plants ont été maintenus dans des conditions d'humidité élevée afin de stimuler l'infection et le développement de la maladie. Les plantes témoins ont été blessées de la même manière et une quantité égale (0,5 g) de mélange de son stérile et non colonisé a été placée dans la blessure et maintenue sous une humidité élevée pour simuler l'environnement de développement de la maladie et assurer la cohérence entre les groupes de traitement.
Méthode de traitement : Des plantules de haricot ont été arrosées avec 500 ml d’une solution aqueuse de L-ornithine (250 mg/l) ou du fongicide Rizolex-T (50 mg/l) par irrigation du sol. Ce traitement a été répété trois fois à 10 jours d’intervalle. Les témoins (traitement placebo) ont été arrosés avec 500 ml d’eau distillée stérile. Tous les traitements ont été réalisés en serre (25 ± 2 °C, 75 ± 1 % d’humidité relative et une photopériode de 8 h de lumière/16 h d’obscurité). Les pots ont été arrosés toutes les deux semaines et traités mensuellement avec un engrais NPK équilibré (20-20-20, contenant 3,6 % de soufre et des oligo-éléments ; Zain Seeds, Égypte) à une concentration de 3 à 4 g/l par pulvérisation foliaire, conformément aux recommandations pour la variété et aux instructions du fabricant. Sauf indication contraire, les feuilles matures entièrement développées (2e et 3e feuilles à partir du haut) ont été collectées dans chaque réplique biologique 72 h après le traitement (hpt), homogénéisées, regroupées et stockées à -80 °C pour des analyses ultérieures, y compris, mais sans s'y limiter, la localisation histochimique in situ des indicateurs de stress oxydatif, la peroxydation lipidique, les antioxydants enzymatiques et non enzymatiques et l'expression des gènes.
L'intensité de l'infection par la moisissure blanche a été évaluée chaque semaine, 21 jours après l'inoculation (JAI), à l'aide d'une échelle de 1 à 9 (Tableau supplémentaire S2), basée sur l'échelle de Petzoldt et Dickson (1996) modifiée par Teran et al. (2006). Brièvement, les tiges et les branches des plants de haricot ont été examinées à partir du point d'inoculation afin de suivre la progression des lésions le long des entre-nœuds et des nœuds. La distance entre le point d'inoculation et le point le plus éloigné de la lésion sur la tige ou la branche a ensuite été mesurée, et un score de 1 à 9 a été attribué en fonction de la localisation de la lésion : 1 indiquant l'absence d'infection visible près du point d'inoculation et 2 à 9 indiquant une augmentation progressive de la taille de la lésion et sa progression le long des nœuds/entre-nœuds (Tableau supplémentaire S2). L'intensité de l'infection par la moisissure blanche a ensuite été convertie en pourcentage à l'aide de la formule 2.
De plus, l'aire sous la courbe de progression de la maladie (AUDPC) a été calculée à l'aide de la formule (Shaner et Finney, 1977), qui a récemment été adaptée à la pourriture blanche du haricot commun (Chauhan et al., 2020) à l'aide de l'équation 3 :
Où Yi représente la gravité de la maladie au temps ti, Yi+1 la gravité de la maladie au temps suivant ti+1, ti le temps de la première mesure (en jours), ti+1 le temps de la mesure suivante (en jours) et n le nombre total de points de mesure. Les paramètres de croissance des plants de haricot, notamment leur hauteur (cm), le nombre de branches par plant et le nombre de feuilles par plant, ont été enregistrés chaque semaine pendant 21 jours pour toutes les répétitions biologiques.
Dans chaque répétition biologique, des échantillons de feuilles (les deuxième et troisième feuilles complètement développées à partir du sommet) ont été prélevés 45 jours après le traitement (15 jours après le dernier traitement). Chaque répétition biologique comprenait cinq pots (deux plantes par pot). Environ 500 mg de tissu broyé ont été utilisés pour l'extraction des pigments photosynthétiques (chlorophylle a, chlorophylle b et caroténoïdes) à l'aide d'acétone à 80 % à 4 °C à l'obscurité. Après 24 h, les échantillons ont été centrifugés et le surnageant a été recueilli pour la détermination colorimétrique des teneurs en chlorophylle a, chlorophylle b et caroténoïdes à l'aide d'un spectrophotomètre UV-160A (Shimadzu Corporation, Japon) selon la méthode de Lichtenthaler (1987), par mesure de l'absorbance à trois longueurs d'onde différentes (λ470, λ646 et λ663 nm). Enfin, la teneur en pigments photosynthétiques a été calculée à l'aide des formules 4 à 6 décrites par Lichtenthaler (1987).
72 h après le traitement, les deuxième et troisième feuilles complètement développées à partir du sommet ont été prélevées dans chaque réplicat biologique pour la localisation histochimique in situ du peroxyde d'hydrogène (H₂O₂) et de l'anion superoxyde (O₂•⁻). Chaque réplicat biologique était constitué de cinq pots (deux plantes par pot). Chaque réplicat biologique a été analysé en double (deux réplicats techniques) afin de garantir la précision, la fiabilité et la reproductibilité de la méthode. Les concentrations de H₂O₂ et d'O₂•⁻ ont été déterminées respectivement à l'aide de 3,3′-diaminobenzidine (DAB ; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Allemagne) à 0,1 % et de nitrobleu de tétrazolium (NBT ; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Allemagne), selon les méthodes décrites par Romero-Puertas et al. (2004) et Adam et al. (1989), avec quelques modifications mineures. Pour la localisation histochimique de H₂O₂ in situ, les feuillets ont été infiltrés sous vide avec une solution de DAB à 0,1 % dans un tampon Tris 10 mM (pH 7,8), puis incubés à température ambiante sous lumière pendant 60 min. Les feuillets ont ensuite été blanchis dans une solution de TCA à 0,15 % (v/v) dans un mélange éthanol/chloroforme 4:1 (v/v) (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Le Caire, Égypte), puis exposés à la lumière jusqu'à leur noircissement. De même, les valves ont été infiltrées sous vide avec un tampon phosphate de potassium 10 mM (pH 7,8) contenant 0,1 % (p/v) de HBT pour la localisation histochimique de O₂•⁻ in situ. Les feuillets ont été incubés à la lumière à température ambiante pendant 20 min, puis blanchis comme décrit précédemment, et enfin exposés à la lumière jusqu'à l'apparition de taches bleu foncé/violettes. L'intensité de la couleur brune (en tant qu'indicateur de H2O2) ou bleu-violet (en tant qu'indicateur de O2•−) résultante a été évaluée à l'aide de la version Fiji du logiciel de traitement d'images ImageJ (http://fiji.sc ; consulté le 7 mars 2024).
Le malondialdéhyde (MDA, marqueur de la peroxydation lipidique) a été dosé selon la méthode de Du et Bramlage (1992), légèrement modifiée. Les feuilles de chaque réplicat biologique (deuxième et troisième feuilles complètement développées à partir du sommet) ont été prélevées 72 h après le traitement. Chaque réplicat biologique comprenait cinq pots (deux plantes par pot). Chaque réplicat biologique a été analysé en double (deux réplicats techniques) afin de garantir la précision, la fiabilité et la reproductibilité de la méthode. Brièvement, 0,5 g de tissu foliaire broyé a été utilisé pour l'extraction du MDA avec de l'acide trichloroacétique à 20 % (TCA ; MilliporeSigma, Burlington, MA, États-Unis) contenant 0,01 % d'hydroxytoluène butylé (BHT ; Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO, États-Unis). La teneur en MDA dans le surnageant a ensuite été déterminée par colorimétrie en mesurant l'absorbance à 532 et 600 nm à l'aide d'un spectrophotomètre UV-160A (Shimadzu Corporation, Japon) et ensuite exprimée en nmol g−1 FW.
Pour l'évaluation des antioxydants enzymatiques et non enzymatiques, les deuxième et troisième feuilles complètement développées à partir du sommet ont été prélevées dans chaque réplicat biologique 72 h après le traitement. Chaque réplicat biologique comprenait cinq pots (deux plantes par pot). Chaque échantillon biologique a été analysé en double (deux échantillons techniques). Deux feuilles ont été broyées à l'azote liquide et utilisées directement pour la détermination des antioxydants enzymatiques et non enzymatiques, des acides aminés totaux, de la teneur en proline, de l'expression génique et de la quantification de l'oxalate.
La teneur totale en composés phénoliques solubles a été déterminée à l'aide du réactif de Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri, États-Unis) selon une méthode légèrement modifiée par rapport à celle décrite par Kahkonen et al. (1999). Brièvement, environ 0,1 g de tissu foliaire homogénéisé a été extrait avec 20 ml de méthanol à 80 % à l'obscurité pendant 24 h. Le surnageant a été recueilli après centrifugation. 0,1 ml de l'extrait a été mélangé à 0,5 ml de réactif de Folin-Ciocalteu (10 %), agité pendant 30 s et incubé à l'obscurité pendant 5 min. Ensuite, 0,5 ml d'une solution de carbonate de sodium à 20 % (Na₂CO₃ ; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Le Caire, Égypte) a été ajouté à chaque tube, le mélange a été homogénéisé et incubé à température ambiante à l'obscurité pendant 1 h. Après incubation, l'absorbance du mélange réactionnel a été mesurée à 765 nm à l'aide d'un spectrophotomètre UV-160A (Shimadzu Corporation, Japon). La concentration en phénols solubles totaux dans les extraits d'échantillons a été déterminée à partir d'une courbe d'étalonnage à l'acide gallique (Fisher Scientific, Hampton, NH, États-Unis) et exprimée en milligrammes d'équivalent acide gallique par gramme de matière fraîche (mg EAG g⁻¹ de matière fraîche).
La teneur totale en flavonoïdes solubles a été déterminée selon la méthode de Djeridane et al. (2006), légèrement modifiée. Brièvement, 0,3 ml de l'extrait méthanolique a été mélangé à 0,3 ml d'une solution de chlorure d'aluminium à 5 % (AlCl₃ ; Fisher Scientific, Hampton, NH, États-Unis), agité vigoureusement, puis incubé à température ambiante pendant 5 min. On a ensuite ajouté 0,3 ml d'une solution d'acétate de potassium à 10 % (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Le Caire, Égypte), mélangé soigneusement et incubé à température ambiante pendant 30 min à l'obscurité. Après incubation, l'absorbance du mélange réactionnel a été mesurée à 430 nm à l'aide d'un spectrophotomètre UV-160A (Shimadzu Corporation, Japon). La concentration totale de flavonoïdes solubles dans les extraits d'échantillons a été déterminée à l'aide d'une courbe d'étalonnage de rutine (TCI America, Portland, OR, États-Unis) puis exprimée en milligrammes d'équivalent rutine par gramme de poids frais (mg RE g-1 poids frais).
La teneur totale en acides aminés libres des feuilles de haricot a été déterminée à l'aide d'un réactif à la ninhydrine modifié (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, États-Unis), selon la méthode proposée par Yokoyama et Hiramatsu (2003) et modifiée par Sun et al. (2006). Brièvement, 0,1 g de tissu broyé a été extrait avec un tampon à pH 5,4, et 200 μL du surnageant ont été mis en réaction avec 200 μL de ninhydrine (2 %) et 200 μL de pyridine (10 % ; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, États-Unis), incubés au bain-marie bouillant pendant 30 min, puis refroidis et analysés par spectrophotométrie UV-visible à 580 nm (spectrophotomètre UV-160A, Shimadzu Corporation, Japon). La proline a quant à elle été dosée par la méthode de Bates (Bates et al., 1973). La proline a été extraite avec de l'acide sulfosalicylique à 3 % (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, États-Unis). Après centrifugation, 0,5 ml du surnageant a été mélangé à 1 ml d'acide acétique glacial (Fisher Scientific, Hampton, NH, États-Unis) et à du réactif de ninhydrine. Le mélange a été incubé à 90 °C pendant 45 min, puis refroidi et l'absorbance a été mesurée à 520 nm à l'aide du même spectrophotomètre. Les teneurs en acides aminés libres totaux et en proline dans les extraits de feuilles ont été déterminées à l'aide de courbes d'étalonnage de glycine et de proline (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, États-Unis), respectivement, et exprimées en mg/g de poids frais.
Pour déterminer l'activité enzymatique des enzymes antioxydantes, environ 500 mg de tissu homogénéisé ont été extraits avec 3 ml de tampon Tris 50 mM (pH 7,8) contenant 1 mM d'EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis) et 7,5 % de polyvinylpyrrolidone (PVP ; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis), centrifugés à 10 000 × g pendant 20 min sous réfrigération (4 °C), et le surnageant (extrait enzymatique brut) a été recueilli (El-Nagar et al., 2023 ; Osman et al., 2023). La catalase (CAT) a ensuite été mise en réaction avec 2 ml de tampon phosphate de sodium 0,1 M (pH 6,5 ; Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO, États-Unis) et 100 μl d’une solution de H₂O₂ à 269 mM afin de déterminer son activité enzymatique selon la méthode d’Aebi (1984) légèrement modifiée (El-Nagar et al., 2023 ; Osman et al., 2023). L’activité enzymatique de la peroxydase dépendante du gaïacol (POX) a été déterminée selon la méthode de Harrach et al. (2009). (2008) avec quelques modifications mineures (El-Nagar et al., 2023 ; Osman et al., 2023). L’activité enzymatique de la polyphénol oxydase (PPO) a été déterminée après réaction avec 2,2 ml de tampon phosphate de sodium 100 mM (pH 6,0), 100 µl de gaïacol (TCI Chemicals, Portland, OR, États-Unis) et 100 µl de H₂O₂ 12 mM. La méthode a été légèrement modifiée par rapport à (El-Nagar et al., 2023 ; Osman et al., 2023). Le dosage a été réalisé après réaction avec 3 ml d’une solution de catéchol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, États-Unis) (0,01 M) fraîchement préparée dans un tampon phosphate 0,1 M (pH 6,0). L'activité CAT a été mesurée en surveillant la décomposition du H2O2 à 240 nm (A240), l'activité POX a été mesurée en surveillant l'augmentation de l'absorbance à 436 nm (A436) et l'activité PPO a été mesurée en enregistrant les fluctuations d'absorbance à 495 nm (A495) toutes les 30 s pendant 3 min à l'aide d'un spectrophotomètre UV-160A (Shimadzu, Japon).
La RT-PCR en temps réel a été utilisée pour détecter les niveaux de transcription de trois gènes liés aux antioxydants, à savoir la catalase peroxysomale (PvCAT1 ; numéro d’accès GenBank : KF033307.1), la superoxyde dismutase (PvSOD ; numéro d’accès GenBank : XM_068639556.1) et la glutathion réductase (PvGR ; numéro d’accès GenBank : KY195009.1), dans les feuilles de haricot (les deuxième et troisième feuilles complètement développées à partir du sommet) 72 h après le dernier traitement. Brièvement, l’ARN a été extrait à l’aide du kit d’extraction d’ARN total Simply P (réf. BSC52S1 ; BioFlux, Biori Technology, Chine) selon le protocole du fabricant. L’ADNc a ensuite été synthétisé à l’aide du kit de synthèse d’ADNc TOPscript™ selon les instructions du fabricant. Les séquences d’amorces des trois gènes sont présentées dans le tableau supplémentaire S3. Le gène PvActin-3 (numéro d'accès GenBank : XM_068616709.1) a été utilisé comme gène de référence et l'expression génique relative a été calculée par la méthode 2-ΔΔCT (Livak et Schmittgen, 2001). La stabilité de l'actine en conditions de stress biotique (interaction incompatible entre des légumineuses communes et le champignon responsable de l'anthracnose, Colletotrichum lindemuthianum) et abiotique (sécheresse, salinité, basses températures) a été démontrée (Borges et al., 2012).
Nous avons initialement réalisé une analyse bioinformatique à l'échelle du génome des protéines oxaloacétate acétylhydrolases (OAH) chez S. sclerotiorum à l'aide de l'outil BLAST protéine-protéine (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Brièvement, nous avons utilisé les séquences OAH d'Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH ; séquence taxonomique : 1191702 ; numéro d'accès GenBank : XP_040799428.1 ; 342 acides aminés) et de Penicillium lagena (PlOAH ; séquence taxonomique : 94218 ; numéro d'accès GenBank : XP_056833920.1 ; 316 acides aminés) comme séquences de référence pour identifier la protéine homologue chez S. sclerotiorum (séquence taxonomique : 5180). BLASTp a été effectué sur les données génomiques de S. sclerotiorum les plus récentes disponibles dans GenBank sur le site Web du National Center for Biotechnology Information (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
De plus, le gène OAH prédit chez S. sclerotiorum (SsOAH) ainsi que l'analyse évolutive et l'arbre phylogénétique des gènes AfOAH chez A. fijiensis CBS 313.89 et PlOAH chez P. lagena ont été inférés par la méthode du maximum de vraisemblance dans MEGA11 (Tamura et al., 2021) et le modèle basé sur la matrice JTT (Jones et al., 1992). L'arbre phylogénétique a été combiné à l'analyse d'alignement multiple des séquences protéiques de tous les gènes OAH prédits (SsOAH) chez S. sclerotiorum et de la séquence requête à l'aide de l'outil d'alignement basé sur les contraintes (COBALT ; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos et Agarwala, 2007). De plus, les séquences d'acides aminés les plus similaires de SsOAH de S. sclerotiorum ont été alignées avec les séquences de requête (AfOAH et PlOAH) (Larkin et al., 2007) à l'aide de ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), et les régions conservées dans l'alignement ont été visualisées à l'aide de l'outil ESPript (version 3.0 ; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
De plus, les domaines fonctionnels représentatifs prédits et les sites conservés de la SsOAH de S. sclerotiorum ont été classés de manière interactive en différentes familles à l'aide de l'outil InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Enfin, la modélisation de la structure tridimensionnelle (3D) de la SsOAH prédite de S. sclerotiorum a été réalisée à l'aide du moteur de reconnaissance d'homologie/analogie protéique Phyre2 (serveur version 2.0 ; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) et validée à l'aide du serveur SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Les structures tridimensionnelles prédites (format PDB) ont été visualisées de manière interactive à l'aide du package UCSF-Chimera (version 1.15 ; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004).
La PCR quantitative en temps réel par fluorescence a été utilisée pour déterminer le niveau de transcription de l'oxaloacétate acétylhydrolase (SsOAH ; numéro d'accès GenBank : XM_001590428.1) dans le mycélium de Sclerotinia sclerotiorum. Brièvement, S. sclerotiorum a été inoculé dans un flacon contenant du milieu PDB et placé dans un incubateur agité (modèle : I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, États-Unis) à 25 ± 2 °C pendant 24 h à 150 tr/min et à l'obscurité constante (24 h) afin de stimuler la croissance mycélienne. Les cellules ont ensuite été traitées avec de la L-ornithine et le fongicide Rizolex-T à des concentrations finales IC50 (environ 40 et 3,2 mg/L, respectivement) puis cultivées pendant 24 h supplémentaires dans les mêmes conditions. Après incubation, les cultures ont été centrifugées à 2 500 tr/min pendant 5 min et le surnageant (mycélium fongique) a été recueilli pour l’analyse de l’expression génique. De même, du mycélium fongique a été prélevé 0, 24, 48, 72, 96 et 120 h après l’infection sur des plantes infectées présentant une moisissure blanche et un mycélium cotonneux à la surface des tissus infectés. L’ARN a été extrait du mycélium fongique, puis l’ADNc a été synthétisé comme décrit précédemment. Les séquences d’amorces pour SsOAH sont indiquées dans le tableau supplémentaire S3. SsActin (numéro d’accès GenBank : XM_001589919.1) a été utilisé comme gène de référence, et l’expression génique relative a été calculée par la méthode 2^-ΔΔCT (Livak et Schmittgen, 2001).
La teneur en acide oxalique a été déterminée dans le bouillon de dextrose de pomme de terre (PDB) et dans des échantillons végétaux infectés par le champignon pathogène Sclerotinia sclerotiorum, selon la méthode de Xu et Zhang (2000), légèrement modifiée. Brièvement, des isolats de S. sclerotiorum ont été inoculés dans des flacons contenant du PDB, puis cultivés dans un incubateur agité (modèle I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, États-Unis) à 150 tr/min à 25 ± 2 °C pendant 3 à 5 jours à l'obscurité constante (24 h) afin de stimuler la croissance mycélienne. Après incubation, la culture fongique a été filtrée sur papier filtre Whatman n° 1, puis centrifugée à 2 500 tr/min pendant 5 min pour éliminer le mycélium résiduel. Le surnageant a été recueilli et conservé à 4 °C pour le dosage ultérieur de l'oxalate. Pour la préparation des échantillons végétaux, environ 0,1 g de fragments de tissu végétal ont été extraits trois fois avec 2 ml d'eau distillée. Les échantillons ont ensuite été centrifugés à 2500 tr/min pendant 5 min, le surnageant a été filtré à sec sur du papier filtre Whatman n° 1 et recueilli pour une analyse ultérieure.
Pour le dosage de l'acide oxalique, le mélange réactionnel a été préparé dans un tube en verre bouché, selon l'ordre suivant : 0,2 ml d'échantillon (ou de filtrat de culture PDB ou de solution standard d'acide oxalique), 0,11 ml de bleu de bromophénol (BPB, 1 mM ; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, États-Unis), 0,198 ml d'acide sulfurique 1 M (H₂SO₄ ; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Le Caire, Égypte) et 0,176 ml de dichromate de potassium 100 mM (K₂Cr₂O₇ ; TCI chemicals, Portland, OR, États-Unis). La solution a ensuite été diluée à 4,8 ml avec de l'eau distillée, vigoureusement agitée et immédiatement placée dans un bain-marie à 60 °C. Après 10 min, la réaction a été arrêtée par l'ajout de 0,5 ml de solution d'hydroxyde de sodium (NaOH ; 0,75 M). L'absorbance (A600) du mélange réactionnel a été mesurée à 600 nm à l'aide d'un spectrophotomètre UV-160 (Shimadzu Corporation, Japon). Le milieu PDB et l'eau distillée ont servi de témoins pour la quantification des filtrats de culture et des échantillons végétaux, respectivement. Les concentrations d'acide oxalique dans les filtrats de culture, exprimées en microgrammes d'acide oxalique par millilitre de milieu PDB (μg·mL⁻¹), et dans les extraits foliaires, exprimées en microgrammes d'acide oxalique par gramme de matière fraîche (μg·g⁻¹ MF), ont été déterminées à l'aide d'une courbe d'étalonnage de l'acide oxalique (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, États-Unis).
Tout au long de l'étude, les expériences ont été conçues selon un plan complètement randomisé (PCR) avec six répétitions biologiques par traitement et cinq pots par répétition biologique (deux plantes par pot), sauf indication contraire. Les répétitions biologiques ont été analysées en double (deux répétitions techniques). Les répétitions techniques ont servi à vérifier la reproductibilité de l'expérience, mais n'ont pas été incluses dans l'analyse statistique afin d'éviter les résultats erronés. Les données ont été analysées statistiquement par analyse de variance (ANOVA), suivie du test de Tukey-Kramer (HSD) (p ≤ 0,05). Pour les expériences in vitro, les valeurs IC50 et IC99 ont été calculées à l'aide du modèle probit et leurs intervalles de confiance à 95 % ont été déterminés.
Quatre isolats ont été collectés dans différents champs de soja du gouvernorat d'El Ghabiya, en Égypte. Sur milieu PDA, tous les isolats ont produit un mycélium blanc crème qui est rapidement devenu blanc cotonneux (Figure 1A), puis beige ou brun au stade sclérotial. Les sclérotes sont généralement denses, noirs, sphériques ou de forme irrégulière, mesurant de 5,2 à 7,7 mm de long et de 3,4 à 5,3 mm de diamètre (Figure 1B). Bien que les quatre isolats aient développé une prolifération marginale de sclérotes en bordure du milieu de culture après 10 à 12 jours d'incubation à 25 ± 2 °C (Figure 1A), le nombre de sclérotes par boîte de Petri différait significativement entre eux (p < 0,001), l'isolat 3 présentant le plus grand nombre de sclérotes (32,33 ± 1,53 sclérotes par boîte ; Figure 1C). De même, l'isolat n° 3 a produit davantage d'acide oxalique sur milieu PDB que les autres isolats (3,33 ± 0,49 μg·mL⁻¹ ; Fig. 1D). Cet isolat présentait les caractéristiques morphologiques et microscopiques typiques du champignon phytopathogène Sclerotinia sclerotiorum. Par exemple, sur milieu PDA, les colonies de l'isolat n° 3 se développaient rapidement, étaient blanc crème (Figure 1A), avec un revers beige ou jaune-brun saumon clair, et nécessitaient 6 à 7 jours à 25 ± 2 °C pour recouvrir entièrement la surface d'une boîte de Petri de 9 cm de diamètre. Sur la base de ces caractéristiques morphologiques et microscopiques, l'isolat n° 3 a été identifié comme Sclerotinia sclerotiorum.
Figure 1. Caractéristiques et pathogénicité d'isolats de S. sclerotiorum provenant de légumineuses cultivées. (A) Croissance mycélienne de quatre isolats de S. sclerotiorum sur milieu PDA, (B) sclérotes de quatre isolats de S. sclerotiorum, (C) nombre de sclérotes (par boîte), (D) sécrétion d'acide oxalique sur milieu PDB (μg.mL⁻¹), et (E) gravité de la maladie (%) des quatre isolats de S. sclerotiorum sur la variété commerciale de légumineuse sensible Giza 3 en conditions de serre. Les valeurs représentent la moyenne ± l'écart-type de cinq répétitions biologiques (n = 5). Des lettres différentes indiquent des différences statistiquement significatives entre les traitements (p < 0,05). (F–H) Des symptômes typiques de pourriture blanche sont apparus sur les tiges aériennes et les siliques, respectivement, 10 jours après l'inoculation avec l'isolat n° 3 (jpi). (I) Une analyse évolutive de la région ITS (Internal Transcribed Spacer) de l'isolat n° 3 de S. sclerotiorum a été réalisée par la méthode du maximum de vraisemblance et comparée à celle de 20 isolats/souches de référence provenant de la base de données du NCBI (National Center for Biotechnology Information) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Les nombres au-dessus des lignes de regroupement indiquent le pourcentage de couverture de la région, et ceux en dessous, la longueur des branches.
De plus, afin de confirmer la pathogénicité, quatre isolats de S. sclerotiorum obtenus ont été utilisés pour inoculer le cultivar de haricot commercial sensible Giza 3 en conditions de serre, conformément aux postulats de Koch (Fig. 1E). Bien que tous les isolats fongiques obtenus soient pathogènes et capables d'infecter le haricot vert (cv. Giza 3), provoquant des symptômes typiques de pourriture blanche sur toutes les parties aériennes (Fig. 1F), en particulier sur les tiges (Fig. 1G) et les gousses (Fig. 1H) 10 jours après l'inoculation (jpi), l'isolat 3 s'est révélé le plus agressif dans deux expériences indépendantes. L'isolat 3 a induit la plus forte gravité de la maladie (%) sur les plants de haricot (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 et 76,7 ± 3,1 respectivement 7, 14 et 21 jours après l'infection ; Fig. 1F).
L'identification de l'isolat n° 3 de S. sclerotiorum, le plus invasif, a été confirmée par séquençage de l'espaceur transcrit interne (ITS) (Fig. 1I). L'analyse phylogénétique entre cet isolat et 20 isolats/souches de référence a révélé une forte similarité (> 99 %). Il est à noter que l'isolat n° 3 de S. sclerotiorum (533 pb) présente une forte similarité avec l'isolat américain LPM36 de S. sclerotiorum, isolé de graines de pois sèches (numéro d'accès GenBank : MK896659.1 ; 540 pb), et avec l'isolat chinois YKY211 de S. sclerotiorum (numéro d'accès GenBank : OR206374.1 ; 548 pb), responsable de la pourriture violette de la tige (Matthiola incana). Ces trois isolats sont regroupés séparément en haut du dendrogramme (Figure 1I). La nouvelle séquence a été déposée dans la base de données NCBI et nommée « Sclerotinia sclerotiorum – isolat YN-25 » (numéro d’accès GenBank : PV202792). L’isolat 3 s’avère le plus invasif ; il a donc été sélectionné pour toutes les expériences ultérieures.
L'activité antibactérienne de la diamine L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Allemagne) à différentes concentrations (12,5, 25, 50, 75, 100 et 125 mg/L) contre l'isolat 3 de S. sclerotiorum a été étudiée in vitro. Il est à noter que la L-ornithine exerce un effet antibactérien et inhibe progressivement la croissance radiale des hyphes de S. sclerotiorum de manière dose-dépendante (figures 2A et 2B). À la concentration la plus élevée testée (125 mg/L), la L-ornithine présente le taux d'inhibition de la croissance mycélienne le plus élevé (99,62 ± 0,27 % ; figure 2B), équivalent à celui du fongicide commercial Rizolex-T (taux d'inhibition de 99,45 ± 0,39 % ; figure 2C) à la concentration la plus élevée testée (10 mg/L), ce qui indique une efficacité similaire.
Figure 2. Activité antibactérienne in vitro de la L-ornithine contre Sclerotinia sclerotiorum. (A) Comparaison de l'activité antibactérienne de différentes concentrations de L-ornithine contre S. sclerotiorum avec celle du fongicide commercial Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Taux d'inhibition (%) de la croissance mycélienne de S. sclerotiorum après traitement avec différentes concentrations de L-ornithine (12,5, 25, 50, 75, 100 et 125 mg/L) ou de Rizolex-T (2, 4, 6, 8 et 10 mg/L). Les valeurs représentent la moyenne ± l'écart-type de cinq réplicats biologiques (n = 5). Des lettres différentes indiquent des différences statistiquement significatives entre les traitements (p < 0,05). (D, E) Analyse de régression par modèle probit de la L-ornithine et du fongicide commercial Rizolex-T. La ligne de régression du modèle probit est représentée par une ligne bleue continue, et l'intervalle de confiance (95%) est représenté par une ligne rouge pointillée.
De plus, une analyse de régression probit a été réalisée et les graphiques correspondants sont présentés dans le tableau 1 et les figures 2D et 2E. En bref, la valeur de pente acceptable (y = 2,92x − 4,67) et les statistiques significatives associées (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 et p < 0,0001 ; figure 2D) de la L-ornithine ont indiqué une activité antifongique accrue contre S. sclerotiorum par rapport au fongicide commercial Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 et p < 0,0001) (tableau 1).
Tableau 1. Valeurs de la concentration inhibitrice à mi-effet (IC50) et de l'IC99 (mg/l) de la L-ornithine et du fongicide commercial « Rizolex-T » contre S. sclerotiorum.
Globalement, la L-ornithine (250 mg/L) a réduit significativement le développement et la gravité de la pourriture blanche sur les plants de haricot commun traités, comparativement aux plants infectés par S. sclerotiorum non traités (témoin ; Figure 3A). Brièvement, alors que la gravité de la maladie chez les plants témoins infectés non traités augmentait progressivement (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 et 92,33 ± 3,06 %), la L-ornithine a réduit significativement cette gravité (en %) tout au long de l’expérience (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 et 26,36 ± 3,07) respectivement à 7, 14 et 21 jours après le traitement (Figure 3A). De même, lorsque des plants de haricot infectés par S. sclerotiorum ont été traités avec 250 mg/L de L-ornithine, l'aire sous la courbe de progression de la maladie (AUDPC) a diminué de 1274,33 ± 33,13 dans le témoin non traité à 281,03 ± 7,95, une valeur légèrement inférieure à celle du témoin positif traité avec 50 mg/L de fongicide Rizolex-T (183,61 ± 7,71 ; Fig. 3B). La même tendance a été observée lors de la seconde expérience.
Figure 3. Effet de l'application exogène de L-ornithine sur le développement de la pourriture blanche du haricot commun causée par Sclerotinia sclerotiorum en serre. (A) Courbe de progression de la pourriture blanche du haricot commun après traitement avec 250 mg/L de L-ornithine. (B) Aire sous la courbe de progression de la maladie (AUDPC) de la pourriture blanche du haricot commun après traitement avec la L-ornithine. Les valeurs représentent la moyenne ± l'écart-type de cinq répétitions biologiques (n = 5). Des lettres différentes indiquent des différences statistiquement significatives entre les traitements (p < 0,05).
L’application exogène de 250 mg/L de L-ornithine a progressivement augmenté la hauteur des plantes (Fig. 4A), le nombre de branches par plante (Fig. 4B) et le nombre de feuilles par plante (Fig. 4C) après 42 jours. Bien que le fongicide commercial Rizolex-T (50 mg/L) ait eu l’effet le plus marqué sur tous les paramètres nutritionnels étudiés, l’application exogène de 250 mg/L de L-ornithine a présenté le deuxième effet le plus important par rapport aux témoins non traités (Fig. 4A–C). En revanche, le traitement à la L-ornithine n'a pas eu d'effet significatif sur la teneur en chlorophylle a (Fig. 4D) et en chlorophylle b (Fig. 4E), pigments photosynthétiques, mais a légèrement augmenté la teneur totale en caroténoïdes (0,56 ± 0,03 mg/g de matière fraîche) par rapport au témoin négatif (0,44 ± 0,02 mg/g de matière fraîche) et au témoin positif (0,46 ± 0,02 mg/g de matière fraîche ; Fig. 4F). Globalement, ces résultats indiquent que la L-ornithine n'est pas phytotoxique pour les légumineuses traitées et pourrait même stimuler leur croissance.
Figure 4. Effet de l'application exogène de L-ornithine sur les caractéristiques de croissance et les pigments photosynthétiques des feuilles de haricot infectées par Sclerotinia sclerotiorum en serre. (A) Hauteur des plantes (cm), (B) Nombre de branches par plante, (C) Nombre de feuilles par plante, (D) Teneur en chlorophylle a (mg g⁻¹ de matière fraîche), (E) Teneur en chlorophylle b (mg g⁻¹ de matière fraîche), (F) Teneur totale en caroténoïdes (mg g⁻¹ de matière fraîche). Les valeurs représentent la moyenne ± l'écart-type de cinq répétitions biologiques (n = 5). Des lettres différentes indiquent des différences statistiquement significatives entre les traitements (p < 0,05).
La localisation histochimique in situ des espèces réactives de l'oxygène (ERO ; exprimées en peroxyde d'hydrogène [H₂O₂]) et des radicaux libres (exprimés en anions superoxyde [O₂•⁻]) a révélé que l'application exogène de L-ornithine (250 mg/L) réduisait significativement l'accumulation de H₂O₂ (96,05 ± 5,33 nmol.g⁻¹ FW ; Fig. 5A) et d'O₂•⁻ (32,69 ± 8,56 nmol.g⁻¹ FW ; Fig. 5B) comparativement à l'accumulation observée chez les plantes infectées non traitées (173,31 ± 12,06 et 149,35 ± 7,94 nmol.g⁻¹ FW, respectivement) et chez les plantes traitées avec 50 mg/L du fongicide commercial Rizolex-T (170,12 ± 9,50 et 157,00). ± 7,81 nmol.g⁻¹ de poids frais, respectivement) à 72 h. Des niveaux élevés de H₂O₂ et d'O₂•⁻ se sont accumulés sous hpt (Fig. 5A, B). De même, le dosage du malondialdéhyde (MDA) par l'acide trichloroacétique (TCA) a montré que les plants de haricot infectés par S. sclerotiorum accumulaient des niveaux plus élevés de MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g de poids frais) dans leurs feuilles (Fig. 5C). Cependant, l'application exogène de L-ornithine a réduit significativement la peroxydation lipidique, comme en témoigne la diminution de la teneur en MDA dans les plants traités (33,08 ± 4,00 nmol.g de poids frais).
Fig. 5. Effet de l'application exogène de L-ornithine sur les principaux marqueurs du stress oxydatif et les mécanismes de défense antioxydants non enzymatiques dans les feuilles de haricot infectées par S. sclerotiorum 72 h après l'infection dans des conditions de serre. (A) Peroxyde d'hydrogène (H₂O₂ ; nmol g⁻¹ MF) à 72 hpt, (B) anion superoxyde (O₂•⁻ ; nmol g⁻¹ MF) à 72 hpt, (C) malondialdéhyde (MDA ; nmol g⁻¹ MF) à 72 hpt, (D) phénols solubles totaux (mg EAG g⁻¹ MF) à 72 hpt, (E) flavonoïdes solubles totaux (mg ER g⁻¹ MF) à 72 hpt, (F) acides aminés libres totaux (mg g⁻¹ MF) à 72 hpt et (G) teneur en proline (mg g⁻¹ MF) à 72 hpt. Les valeurs représentent la moyenne ± l'écart type (moyenne ± ET) de 5 réplicats biologiques (n = 5). Des lettres différentes indiquent des différences statistiquement significatives entre les traitements (p < 0,05).