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Les nanoparticules d'insuline (NP) à forte concentration trouvent diverses applications dans différentes formes galéniques. Ce travail vise à évaluer l'effet des procédés de lyophilisation et de séchage par atomisation sur la structure des nanoparticules de chitosane chargées en insuline, avec ou sans mannitol comme cryoprotecteur. Nous avons également évalué la qualité de ces nanoparticules par redissolution. Avant déshydratation, la taille des nanoparticules réticulées chitosane/tripolyphosphate de sodium/insuline était optimisée à 318 nm, l'indice de polydispersité (PDI) à 0,18, l'efficacité d'encapsulation à 99,4 % et la concentration à 25,01 %. Après reconstitution, toutes les nanoparticules, à l'exception de celles produites par lyophilisation sans mannitol, ont conservé leur structure sphérique. Comparées aux nanoparticules contenant du mannitol et déshydratées par atomisation, les nanoparticules séchées par atomisation sans mannitol présentaient également la plus petite taille moyenne (376 nm) et la concentration la plus élevée. (25,02 %) avec un taux d'encapsulation similaire (98,7 %) et un indice de polydispersité (PDI) de 0,20, obtenus par séchage ou lyophilisation. Les nanoparticules séchées par atomisation sans mannitol ont également permis la libération d'insuline la plus rapide et l'absorption cellulaire la plus efficace. Ce travail démontre que le séchage par atomisation permet de déshydrater les nanoparticules d'insuline sans cryoprotecteurs, contrairement aux méthodes de lyophilisation conventionnelles, offrant ainsi une capacité de chargement accrue, des besoins en additifs réduits et des coûts d'exploitation moindres.
Depuis sa découverte en 1922^1,2,3, l'insuline et ses préparations pharmaceutiques ont sauvé la vie de nombreux patients atteints de diabète de type 1 (DT1) et de diabète de type 2 (DT2). Cependant, en raison de sa structure protéique de haut poids moléculaire, l'insuline s'agrège facilement, est dégradée par les enzymes protéolytiques et éliminée par l'effet de premier passage hépatique. Les personnes diagnostiquées avec un diabète de type 1 doivent recevoir des injections d'insuline à vie. De nombreux patients initialement diagnostiqués avec un diabète de type 2 nécessitent également des injections d'insuline au long cours. Ces injections quotidiennes sont une source importante de douleurs et d'inconfort pour ces personnes, avec des répercussions négatives sur leur santé mentale. C'est pourquoi d'autres modes d'administration de l'insuline, moins inconfortables, comme l'administration orale, font l'objet d'études approfondies⁵, car ils pourraient améliorer la qualité de vie d'environ 5 milliards de personnes diabétiques dans le monde.
La technologie des nanoparticules a permis une avancée significative dans l'administration orale d'insuline^4,6,7. Elle permet d'encapsuler et de protéger efficacement l'insuline de la dégradation, assurant ainsi une délivrance ciblée à des sites spécifiques de l'organisme. Cependant, l'utilisation de formulations nanoparticulaires présente plusieurs limitations, principalement dues à des problèmes de stabilité des suspensions de particules. Une certaine agrégation peut se produire lors du stockage, réduisant la biodisponibilité des nanoparticules chargées en insuline⁸. De plus, la stabilité chimique de la matrice polymère des nanoparticules et de l'insuline doit également être prise en compte pour garantir la stabilité des nanoparticules d'insuline (NP). Actuellement, la lyophilisation est la méthode de référence pour créer des NP stables tout en prévenant les modifications indésirables pendant le stockage⁹.
Cependant, la lyophilisation nécessite l'ajout de cryoprotecteurs afin de préserver la structure sphérique des nanoparticules (NP) des contraintes mécaniques exercées par les cristaux de glace. Ceci réduit considérablement la quantité de nanoparticules d'insuline chargées après lyophilisation, le cryoprotecteur occupant la majeure partie du rapport massique. Par conséquent, les NP d'insuline ainsi produites sont souvent inadaptées à la fabrication de formulations en poudre sèche, telles que les comprimés et les films oraux, car de grandes quantités de nanoparticules sèches sont nécessaires pour atteindre la fenêtre thérapeutique de l'insuline.
La pulvérisation est un procédé industriel bien connu et peu coûteux pour la production de poudres sèches à partir de phases liquides dans l'industrie pharmaceutique^10,11. La maîtrise du processus de formation des particules permet une encapsulation optimale de plusieurs composés bioactifs^12,13. De plus, ce procédé est devenu une technique efficace pour la préparation de protéines encapsulées destinées à l'administration orale. Lors de la pulvérisation, l'eau s'évapore très rapidement, ce qui contribue à maintenir une basse température au cœur des particules^11,14 et permet ainsi l'encapsulation de composants thermosensibles. Avant la pulvérisation, le matériau d'enrobage doit être soigneusement homogénéisé avec la solution contenant les ingrédients à encapsuler^11,14. Contrairement à la lyophilisation, l'homogénéisation préalable à l'encapsulation lors de la pulvérisation améliore l'efficacité d'encapsulation pendant la déshydratation. Le procédé d'encapsulation par pulvérisation ne nécessitant pas de cryoprotecteurs, il permet de produire des nanoparticules séchées à forte concentration.
Cette étude décrit la production de nanoparticules chargées en insuline par réticulation de chitosane et de tripolyphosphate de sodium via une méthode de gélification ionique. La gélification ionique est une méthode de préparation permettant la synthèse de nanoparticules par interactions électrostatiques entre deux ou plusieurs espèces ioniques dans des conditions spécifiques. Les techniques de lyophilisation et de séchage par atomisation ont été utilisées pour déshydrater les nanoparticules réticulées optimisées de chitosane/tripolyphosphate de sodium/insuline. Après déshydratation, leur morphologie a été analysée par microscopie électronique à balayage (MEB). Leur capacité de recombinaison a été évaluée en mesurant leur distribution granulométrique, leur charge de surface, leur indice de polydispersité (PDI), leur efficacité d'encapsulation et leur taux de chargement. La qualité des nanoparticules resolubilisées, obtenues par différentes méthodes de déshydratation, a également été évaluée en comparant leur protection contre l'insuline, leur profil de libération et leur efficacité d'internalisation cellulaire.
Le pH de la solution mixte et le rapport chitosane/insuline sont deux facteurs clés qui influencent la taille des particules et l'efficacité d'encapsulation (EE) des nanoparticules finales, car ils affectent directement le processus de gélification ionotropique. Le pH de la solution mixte est fortement corrélé à la taille des particules et à l'efficacité d'encapsulation (Fig. 1a). Comme le montre la Fig. 1a, lorsque le pH augmente de 4,0 à 6,0, la taille moyenne des particules (nm) diminue et l'EE augmente significativement. En revanche, lorsque le pH atteint 6,5, la taille moyenne des particules commence à augmenter tandis que l'EE reste inchangée. L'augmentation du rapport chitosane/insuline entraîne également une augmentation de la taille moyenne des particules. Par ailleurs, aucune variation de l'EE n'est observée pour des nanoparticules préparées avec un rapport massique chitosane/insuline supérieur à 2,5:1 (Fig. 1b). Les conditions de préparation optimales dans cette étude (pH 6,0, rapport massique chitosane/insuline de 2,5:1) sont donc de 2,5:1. Des nanoparticules chargées en insuline (rapport 2,5:1) ont été préparées pour des études ultérieures. Dans ces conditions, la taille moyenne des nanoparticules d'insuline a été optimisée à 318 nm (Fig. 1c), l'indice de polydispersité (PDI) à 0,18, l'efficacité d'encapsulation à 99,4 %, le potentiel zêta à 9,8 mV et la charge en insuline à 25,01 % (m/m). L'observation au microscope électronique à transmission (MET) a révélé que les nanoparticules optimisées étaient approximativement sphériques et bien délimitées, avec une taille relativement uniforme (Fig. 1d).
Optimisation des paramètres des nanoparticules d'insuline : (a) effet du pH sur le diamètre moyen et l'efficacité d'encapsulation (EE) des nanoparticules d'insuline (préparées avec un rapport massique de chitosane et d'insuline de 5:1) ; (b) influence du rapport massique de chitosane et d'insuline sur le diamètre moyen et l'efficacité d'encapsulation (EE) des NP d'insuline (préparées à pH 6) ; (c) distribution granulométrique des nanoparticules d'insuline optimisées ; (d) micrographie TEM des NP d'insuline optimisées.
Il est bien connu que le chitosane est un polyélectrolyte faible, de pKa 6,5. En milieu acide, il est chargé positivement car son groupe amine principal est protoné par les ions hydrogène¹⁵. De ce fait, il est souvent utilisé comme support pour encapsuler des macromolécules chargées négativement. Dans cette étude, le chitosane a été utilisé pour encapsuler l'insuline, dont le point isoélectrique est de 5,3. Le chitosane étant utilisé comme matériau de revêtement, l'épaisseur de la couche externe des nanoparticules augmente avec sa proportion, ce qui conduit à une taille moyenne de particules plus importante. De plus, une plus grande quantité de chitosane permet d'encapsuler davantage d'insuline. Dans notre cas, l'efficacité d'encapsulation (EE) était maximale pour un rapport chitosane/insuline de 2,5:1, et aucune variation significative de l'EE n'a été observée pour des rapports supérieurs.
Outre le rapport chitosane/insuline, le pH a également joué un rôle crucial dans la préparation des nanoparticules (NP). Gan et al.¹⁷ ont étudié l'effet du pH sur la taille des nanoparticules de chitosane. Ils ont observé une diminution continue de la taille des particules jusqu'à un pH de 6,0, puis une augmentation significative à un pH supérieur à 6,0, ce qui concorde avec nos observations. Ce phénomène s'explique par le fait qu'avec l'augmentation du pH, la molécule d'insuline acquiert une charge de surface négative, favorisant ainsi les interactions électrostatiques avec le complexe chitosane/tripolyphosphate de sodium (TPP), ce qui conduit à une petite taille de particules et à une efficacité d'encapsulation (EE) élevée. Cependant, lorsque le pH a été ajusté à 6,5, les groupements aminés du chitosane ont été déprotonés, entraînant un repliement de la molécule. Par conséquent, un pH élevé réduit l'exposition des ions aminés au TPP et à l'insuline, ce qui se traduit par une réticulation plus faible, une taille moyenne finale des particules plus importante et une EE plus faible.
L'analyse des propriétés morphologiques des nanoparticules lyophilisées et atomisées peut orienter le choix des meilleures techniques de déshydratation et de mise en poudre. La méthode privilégiée doit garantir la stabilité du principe actif, une forme de particule uniforme, une charge médicamenteuse élevée et une bonne solubilité dans la solution initiale. Dans cette étude, afin de mieux comparer les deux techniques, des nanoparticules d'insuline avec ou sans 1 % de mannitol ont été utilisées lors de la déshydratation. Le mannitol est utilisé comme agent de charge ou cryoprotecteur dans diverses formulations de poudres sèches pour la lyophilisation et l'atomisation. Pour les nanoparticules d'insuline lyophilisées sans mannitol, comme illustré sur la figure 2a, une structure de poudre très poreuse avec de grandes surfaces irrégulières et rugueuses a été observée par microscopie électronique à balayage (MEB). Quelques particules distinctes ont été détectées dans la poudre après déshydratation (figure 2e). Ces résultats indiquent que la plupart des nanoparticules se sont décomposées lors de la lyophilisation en l'absence de cryoprotecteur. Pour les nanoparticules d'insuline lyophilisées et atomisées contenant 1 % de mannitol, des nanoparticules sphériques à surfaces lisses ont été observées. Les nanoparticules d'insuline séchées par atomisation sans mannitol sont restées sphériques, mais leur surface était ridée (Fig. 2c). Ces caractéristiques sphériques et ridées sont analysées plus en détail dans la section consacrée au comportement de libération et aux tests d'absorption cellulaire. L'aspect visuel des nanoparticules séchées montre que les nanoparticules séchées par atomisation sans mannitol, ainsi que celles lyophilisées et séchées par atomisation avec mannitol, ont donné des poudres fines (Fig. 2f, g, h). Plus la surface de contact entre les particules est grande, plus la solubilité est élevée et, par conséquent, plus la vitesse de libération est importante.
Morphologie de différentes nanoparticules d'insuline déshydratées : (a) Image MEB de nanoparticules d'insuline lyophilisées sans mannitol ; (b) Image MEB de nanoparticules d'insuline lyophilisées avec mannitol ; (c) Image MEB de nanoparticules d'insuline séchées par pulvérisation sans mannitol ; (d) Image MEB de nanoparticules d'insuline séchées par pulvérisation avec mannitol ; (e) Image de poudre de nanoparticules d'insuline lyophilisées sans mannitol ; (f) Image de nanoparticules d'insuline lyophilisées avec mannitol ; (g) Image de poudre de nanoparticules d'insuline séchées par pulvérisation sans mannitol ; (h) Image de poudre de nanoparticules d'insuline séchées par pulvérisation avec mannitol.
Lors de la lyophilisation, le mannitol agit comme cryoprotecteur, maintenant les nanoparticules (NP) sous forme amorphe et les protégeant des dommages causés par les cristaux de glace¹⁹. En revanche, la pulvérisation ne comporte pas d'étape de congélation. Le mannitol est donc inutile dans cette méthode. De fait, les NP pulvérisées sans mannitol sont plus fines, comme décrit précédemment. Cependant, le mannitol peut servir de charge lors de la pulvérisation pour conférer aux NP une structure plus sphérique²⁰ (Fig. 2d), ce qui favorise une libération uniforme des NP encapsulées. Par ailleurs, la présence de particules de grande taille est clairement visible dans les NP d'insuline contenant du mannitol, qu'elles soient lyophilisées ou pulvérisées (Fig. 2b,d). Ceci pourrait être dû à l'accumulation de mannitol au cœur des particules, en association avec l'insuline encapsulée. Couche de chitosane. Il convient de noter que dans cette étude, afin de garantir que la structure sphérique reste intacte après déshydratation, le rapport mannitol/chitosane est maintenu à 5:1, de sorte qu'une grande quantité de charge peut également augmenter la taille des particules des NP séchées.
La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier par réflexion totale atténuée (FTIR-ATR) a permis de caractériser le mélange physique d'insuline libre, de chitosane, de TPP et d'insuline. Toutes les nanoparticules déshydratées ont été caractérisées par spectroscopie FTIR-ATR. Notamment, des intensités de bande à 1641, 1543 et 1412 cm⁻¹ ont été observées dans les nanoparticules encapsulées lyophilisées avec du mannitol et dans les nanoparticules séchées par pulvérisation avec et sans mannitol (Fig. 3). Comme précédemment rapporté, ces augmentations de résistance étaient associées à la réticulation entre le chitosane, le TPP et l'insuline. L'étude de l'interaction entre le chitosane et l'insuline a montré que, dans les spectres FTIR des nanoparticules de chitosane chargées en insuline, la bande du chitosane chevauchait celle de l'insuline, augmentant l'intensité des bandes carbonyle (1641 cm⁻¹) et amine (1543 cm⁻¹). Les groupes tripolyphosphate du TPP sont liés aux groupes ammonium du chitosane. formant une bande à 1412 cm-1.
Spectres FTIR-ATR de l'insuline libre, du chitosane, des mélanges physiques de chitosane/TPP/insuline et des NP déshydratés par différentes méthodes.
De plus, ces résultats concordent avec ceux obtenus par microscopie électronique à balayage (MEB), qui ont montré que les nanoparticules (NP) encapsulées restaient intactes après pulvérisation et lyophilisation en présence de mannitol. En revanche, en l'absence de mannitol, seule la pulvérisation a permis d'obtenir des particules encapsulées. Par ailleurs, les spectres FTIR-ATR des NP lyophilisées sans mannitol étaient très similaires à ceux du mélange physique de chitosane, de TPP et d'insuline. Ce résultat indique que les liaisons croisées entre le chitosane, le TPP et l'insuline sont absentes des NP lyophilisées sans mannitol. La structure des NP a été détruite lors de la lyophilisation sans cryoprotecteur, comme le montrent les résultats MEB (Fig. 2a). Compte tenu de la morphologie et des résultats FTIR des NP d'insuline déshydratées, seules les NP lyophilisées, pulvérisées et sans mannitol ont été utilisées pour les expériences de reconstitution. Seules les NP sans mannitol se sont décomposées lors de la lyophilisation. Déshydratation. Discuter.
La déshydratation est utilisée pour le stockage à long terme et le retraitement en d'autres formulations. La capacité des nanoparticules (NP) sèches à se reconstituer après stockage est essentielle pour leur utilisation dans différentes formulations telles que les comprimés et les films. Nous avons observé que la taille moyenne des particules de NP d'insuline lyophilisées en l'absence de mannitol n'augmentait que légèrement après reconstitution. En revanche, la taille des particules de nanoparticules d'insuline lyophilisées et séchées par pulvérisation avec du mannitol augmentait significativement (Tableau 1). L'indice de polydispersité (PDI) et l'efficacité d'encapsulation (EE) n'ont pas été significativement modifiés (p > 0,05) après recombinaison de toutes les NP de cette étude (Tableau 1). Ce résultat indique que la plupart des particules sont restées intactes après redissolution. Cependant, l'ajout de mannitol a entraîné une forte réduction de la charge en insuline des nanoparticules de mannitol lyophilisées et lyophilisées (Tableau 1). En revanche, la charge en insuline des NP lyophilisées sans mannitol est restée inchangée (Tableau 1).
Il est bien connu que le taux de chargement des nanoparticules est crucial pour l'administration de médicaments. Pour les nanoparticules faiblement chargées, de très grandes quantités de matériau sont nécessaires pour atteindre le seuil thérapeutique. Cependant, la viscosité élevée de ces fortes concentrations de nanoparticules rend l'administration orale et les formulations injectables respectivement peu pratiques et difficiles à mettre en œuvre²². De plus, les nanoparticules d'insuline peuvent également servir à la fabrication de comprimés et de biofilms visqueux^23,24, ce qui requiert de grandes quantités de nanoparticules à faible taux de chargement. Il en résulte des comprimés volumineux et des biofilms épais, inadaptés à l'administration orale. Par conséquent, les nanoparticules déshydratées à forte charge en insuline sont particulièrement recherchées. Nos résultats suggèrent que la forte charge en insuline des nanoparticules séchées par pulvérisation sans mannitol offre de nombreux avantages pour ces modes d'administration alternatifs.
Toutes les nanoparticules déshydratées ont été conservées au réfrigérateur pendant trois mois. Les résultats de la microscopie électronique à balayage (MEB) ont montré que la morphologie de toutes les nanoparticules déshydratées n'a pas subi de modification significative au cours de cette période (Fig. 4). Après reconstitution dans l'eau, toutes les nanoparticules ont présenté une légère diminution de leur efficacité d'encapsulation (EE) et ont libéré une faible quantité d'insuline (environ 5 %) pendant les trois mois de conservation (Tableau 2). Cependant, la taille moyenne de toutes les nanoparticules a augmenté. La taille des nanoparticules séchées par pulvérisation sans mannitol a atteint 525 nm, tandis que celle des nanoparticules séchées par pulvérisation et lyophilisées avec mannitol a atteint respectivement 872 et 921 nm (Tableau 2).
Morphologie de différentes NP d'insuline déshydratées stockées pendant trois mois : (a) Image MEB de NP d'insuline lyophilisées avec du mannitol ; (b) Image MEB de nanoparticules d'insuline séchées par pulvérisation sans mannitol ; (c) Images MEB sans mannitol de NP d'insuline séchées par pulvérisation.
De plus, des précipités ont été observés dans les nanoparticules d'insuline reconstituées, séchées par atomisation avec du mannitol puis lyophilisées (Fig. S2). Ceci pourrait être dû à la mauvaise suspension des grosses particules dans l'eau. L'ensemble des résultats précédents démontre que la technique de séchage par atomisation permet de protéger les nanoparticules d'insuline de la déshydratation et qu'il est possible d'obtenir des concentrations élevées de nanoparticules d'insuline sans ajout de charges ni de cryoprotecteurs.
La rétention d'insuline a été testée dans un milieu à pH 2,5 avec de la pepsine, de la trypsine et de l'α-chymotrypsine afin de démontrer la capacité protectrice des nanoparticules (NP) contre la digestion enzymatique après déshydratation. La rétention d'insuline des NP déshydratées a été comparée à celle des NP fraîchement préparées, l'insuline libre servant de témoin négatif. Dans cette étude, l'insuline libre a montré une élimination rapide en 4 h pour les trois traitements enzymatiques (Fig. 5a–c). En revanche, les tests d'élimination d'insuline des NP lyophilisées avec du mannitol et des NP atomisées avec ou sans mannitol ont montré une protection significativement plus élevée de ces NP contre la digestion enzymatique, similaire à celle des NP d'insuline fraîchement préparées (figure 1). Grâce aux nanoparticules, plus de 50 %, 60 % et 75 % de l'insuline ont pu être protégés en 4 h en présence de pepsine, de trypsine et d'α-chymotrypsine, respectivement (Fig. 1a–c). 5a–c). Cette capacité protectrice de l'insuline peut augmenter la probabilité d'une absorption plus importante d'insuline dans la circulation sanguine25. Ces résultats suggèrent que le séchage par pulvérisation avec ou sans mannitol et la lyophilisation avec mannitol peuvent préserver la capacité protectrice de l'insuline des NP après déshydratation.
Comportement de protection et de libération des nanoparticules d'insuline déshydratées : (a) protection de l'insuline dans une solution de pepsine ; (b) protection de l'insuline dans une solution de trypsine ; (c) protection de l'insuline par une solution d'α-chymotrypsine ; (d) comportement de libération des nanoparticules déshydratées dans une solution à pH = 2,5 ; (e) comportement de libération des nanoparticules déshydratées dans une solution à pH = 6,6 ; (f) comportement de libération des nanoparticules déshydratées dans une solution à pH = 7,0.
Des nanoparticules d'insuline sèches fraîchement préparées et reconstituées ont été incubées dans différents tampons (pH = 2,5, 6,6, 7,0) à 37 °C, simulant l'environnement de pH de l'estomac, du duodénum et de la partie supérieure de l'intestin grêle, afin d'examiner l'effet de l'insuline sur la résistance à l'insuline. Comportement de libération dans différents environnements. Fragment du tractus gastro-intestinal. À pH 2,5, les nanoparticules (NP) chargées en insuline et les NP d’insuline sèche resolubilisées ont présenté une libération initiale rapide au cours de la première heure, suivie d’une libération lente sur les 5 heures suivantes (Fig. 5d). Cette libération rapide initiale est très probablement due à une désorption rapide en surface des molécules de protéines qui ne sont pas totalement immobilisées dans la structure interne de la particule. À pH 6,5, les NP chargées en insuline et les NP d’insuline sèche reconstituées ont présenté une libération lente et régulière sur 6 h, le pH de la solution de test étant similaire à celui de la solution de préparation des NP (Fig. 5e). À pH 7, les NP étaient instables et se sont presque complètement décomposées au cours des deux premières heures (Fig. 5f). Ceci est dû à la déprotonation du chitosane à pH plus élevé, ce qui entraîne un réseau polymère moins compact et la libération de l’insuline chargée.
De plus, les nanoparticules d'insuline séchées par pulvérisation sans mannitol ont présenté un profil de libération plus rapide que les autres nanoparticules déshydratées (Fig. 5d–f). Comme décrit précédemment, les nanoparticules d'insuline reconstituées et séchées sans mannitol présentaient la plus petite taille de particules. Les petites particules offrent une plus grande surface spécifique, de sorte que la majeure partie du médicament se trouve à la surface ou à proximité de celle-ci, ce qui entraîne une libération rapide du médicament²⁶.
La cytotoxicité des NP a été étudiée par le test MTT. Comme le montre la figure S4, il a été constaté que toutes les NP déshydratées n'avaient aucun effet significatif sur la viabilité cellulaire à des concentrations de 50 à 500 μg/ml, ce qui suggère que toutes les NP déshydratées peuvent être utilisées en toute sécurité pour atteindre la fenêtre thérapeutique.
Le foie est le principal organe par lequel l'insuline exerce ses fonctions physiologiques. Les cellules HepG2, une lignée cellulaire d'hépatome humain, sont couramment utilisées comme modèle d'absorption hépatocytaire in vitro. Dans cette étude, les cellules HepG2 ont été utilisées pour évaluer l'absorption cellulaire de nanoparticules (NP) déshydratées par lyophilisation et atomisation. L'absorption cellulaire a été évaluée par microscopie confocale à balayage laser (CLSM) et observation visuelle après plusieurs heures d'incubation avec de l'insuline FITC libre à une concentration de 25 μg/mL, des NP chargées en insuline FITC fraîchement préparées et des NP chargées en insuline FITC déshydratées à des concentrations d'insuline équivalentes. Les NP lyophilisées sans mannitol ont été détruites lors de la déshydratation et n'ont donc pas été évaluées dans ce test. Les intensités de fluorescence intracellulaire des NP chargées en insuline fraîchement préparées, des NP lyophilisées avec mannitol et des NP atomisées avec et sans mannitol (Fig. 6a) ont été mesurées. 4,3, 2,6, 2,4 et 4,1 fois plus élevées que celles du groupe insuline-FITC libre, respectivement (Fig. 6b). Ces résultats suggèrent que l'insuline encapsulée est plus efficace pour l'absorption cellulaire que l'insuline libre, principalement en raison de la plus petite taille des nanoparticules chargées d'insuline produites dans l'étude.
Absorption par les cellules HepG2 après 4 h d'incubation avec des NP fraîchement préparées et des NP déshydratées : (a) Distribution de l'absorption de l'insuline FITC par les cellules HepG2. (b) Moyenne géométrique des intensités de fluorescence analysées par cytométrie en flux (n = 3), *P < 0,05 par rapport à l'insuline libre.
De même, les images CLSM ont montré que les intensités de fluorescence FITC des nanoparticules chargées en insuline-FITC fraîchement préparées et des nanoparticules chargées en insuline-FITC séchées par pulvérisation (sans mannitol) étaient nettement supérieures à celles des autres échantillons (Fig. 6a). Par ailleurs, l'ajout de mannitol a augmenté la viscosité de la solution, ce qui a accru la résistance à l'internalisation cellulaire et, par conséquent, diminué la prolifération induite par l'insuline. Ces résultats suggèrent que les nanoparticules séchées par pulvérisation sans mannitol ont présenté la meilleure efficacité d'internalisation cellulaire, car leur taille était inférieure à celle des nanoparticules lyophilisées après redissolution.
Le chitosane (masse moléculaire moyenne de 100 kDa, désacétylé à 75–85 %) a été acheté chez Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada). Le tripolyphosphate de sodium (TPP) a été acheté chez VWR (Radnor, Pennsylvanie, États-Unis). L’insuline humaine recombinante utilisée dans cette étude provenait de Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, États-Unis). L’insuline humaine marquée à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et le dichlorhydrate de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ont été achetés chez Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada). La lignée cellulaire HepG2 a été obtenue auprès de l’ATCC (Manassas, Virginie, États-Unis). Tous les autres réactifs étaient de qualité analytique ou chromatographique.
Préparer une solution de CS à 1 mg/ml en la dissolvant dans de l'eau bidistillée (eau DD) contenant 0,1 % d'acide acétique. Préparer des solutions de TPP et d'insuline à 1 mg/ml en les dissolvant respectivement dans de l'eau DD et de l'acide acétique à 0,1 %. La pré-émulsion a été préparée à l'aide d'un homogénéisateur à grande vitesse Polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind., Westbury, NY, États-Unis). Le procédé de préparation est le suivant : tout d'abord, 2 ml de solution de TPP sont ajoutés à 4 ml de solution d'insuline, et le mélange est agité pendant 30 min jusqu'à homogénéisation complète. Ensuite, la solution obtenue est ajoutée goutte à goutte à la solution de CS à l'aide d'une seringue sous agitation à grande vitesse (10 000 tr/min). Les mélanges sont maintenus sous agitation à grande vitesse (15 000 tr/min) dans un bain de glace pendant 30 min, puis leur pH est ajusté afin d'obtenir des nanoparticules d'insuline réticulées. Pour homogénéiser davantage les nanoparticules d'insuline et réduire leur taille, elles ont été soniqués pendant 30 minutes supplémentaires dans un bain de glace à l'aide d'un sonicateur de type sonde (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Allemagne).
Les nanoparticules d'insuline (NPs) ont été testées pour leur diamètre moyen (Z-average), leur indice de polydispersité (PDI) et leur potentiel zêta par diffusion dynamique de la lumière (DLS) à l'aide d'un Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Autriche) après dilution dans de l'eau désionisée à 25 °C. La morphologie et la distribution granulométrique ont été caractérisées par microscopie électronique à transmission (MET) à l'aide d'un microscope Hitachi H7600 (Hitachi, Tokyo, Japon), et les images ont ensuite été analysées avec le logiciel d'imagerie Hitachi (Hitachi, Tokyo, Japon). Pour évaluer l'efficacité d'encapsulation (EE) et la capacité de chargement (LC) des NPs d'insuline, ces dernières ont été pipetées dans des tubes d'ultrafiltration avec un seuil de coupure de 100 kDa et centrifugées à 500 g pendant 30 min. L'insuline non encapsulée dans le filtrat a été quantifiée par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) à l'aide d'un système Agilent série 1100 (Agilent, Santa Clara, Californie, États-Unis) composé d'une pompe quaternaire. L'échantillonneur automatique, le four à colonne et le détecteur DAD ont été utilisés. L'insuline a été analysée sur une colonne C18 (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, États-Unis) et détectée à 214 nm. La phase mobile était composée d'acétonitrile et d'eau contenant 0,1 % de TFA, avec un gradient de 10/90 à 100/0, pendant 10 minutes. Le débit de la phase mobile était de 1,0 ml/min. La température de la colonne était fixée à 20 °C. Les pourcentages d'EE et de LC ont été calculés à l'aide des équations (1) et (2).
Différents rapports CS/insuline, allant de 2,0 à 4,0, ont été testés afin d'optimiser les nanoparticules d'insuline. Différentes quantités de solution de CS ont été ajoutées lors de la préparation, tandis que le mélange insuline/TPP restait constant. Les nanoparticules d'insuline ont été préparées à un pH compris entre 4,0 et 6,5 en contrôlant précisément le pH du mélange après l'ajout de toutes les solutions (insuline, TPP et CS). L'efficacité d'encapsulation (EE) et la taille des nanoparticules d'insuline ont été évaluées à différents pH et rapports massiques CS/insuline afin d'optimiser leur formation.
Les nanoparticules d'insuline optimisées ont été placées dans un récipient en aluminium et recouvertes de papier absorbant, le tout étant maintenu par du ruban adhésif. Les récipients vissés ont ensuite été placés dans un lyophilisateur Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, États-Unis) équipé d'un séchoir à plateaux. La température et la pression sous vide ont été réglées à -10 °C et 0,350 Torr pendant les deux premières heures, puis à 0 °C et 0,120 Torr pendant les 22 heures restantes (sur 24 heures) afin d'obtenir des nanoparticules d'insuline lyophilisées.
Le séchoir par pulvérisation Buchi Mini B-290 (BÜCHI, Flawil, Suisse) a été utilisé pour générer de l'insuline encapsulée. Les paramètres de séchage sélectionnés étaient : température 100 °C, débit d'alimentation 3 L/min et débit de gaz 4 L/min.
Les nanoparticules d'insuline avant et après déshydratation ont été caractérisées par spectroscopie FTIR-ATR. Les nanoparticules déshydratées, ainsi que l'insuline libre et le chitosane, ont été analysées à l'aide d'un spectrophotomètre FTIR Spectrum 100 (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, États-Unis) équipé d'un accessoire d'échantillonnage ATR universel (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, États-Unis). Les signaux moyens ont été obtenus à partir de 16 acquisitions à une résolution de 4 cm⁻² dans la gamme de fréquences de 4000 à 600 cm⁻².
La morphologie des nanoparticules d'insuline sèches a été évaluée par microscopie électronique à balayage (MEB) à l'aide d'un microscope Helios NanoLab 650 à faisceau d'ions focalisés (FIB-MEB) (FEI, Hillsboro, Oregon, États-Unis). Les principaux paramètres utilisés étaient une tension de 5 keV et un courant de 30 mA.
Toutes les nanoparticules d'insuline déshydratées ont été redissoutes dans de l'eau bidistillée. La taille des particules, l'indice de polydispersité (PDI), l'efficacité d'encapsulation (EE) et la capacité de rétention d'eau (LC) ont été mesurés à nouveau selon la méthode décrite précédemment afin d'évaluer leur qualité après déshydratation. La stabilité des nanoparticules d'anhydroinsuline a également été évaluée en testant leurs propriétés après un stockage prolongé. Dans cette étude, toutes les nanoparticules déshydratées ont été conservées au réfrigérateur pendant trois mois. Après cette période de stockage, leur morphologie, leur taille, leur PDI, leur EE et leur LC ont été analysés.
Dissoudre 5 mL de nanoparticules reconstituées dans 45 mL de solution simulant soit du fluide gastrique (pH 1,2, contenant 1 % de pepsine), soit du fluide intestinal (pH 6,8, contenant 1 % de trypsine), soit une solution de chymotrypsine (100 µg/mL, dans un tampon phosphate, pH 7,8), afin d'évaluer l'efficacité de l'insuline pour protéger les nanoparticules après déshydratation. Les solutions ont été incubées à 37 °C sous agitation à 100 tr/min. 500 µL de la solution ont été prélevés à différents intervalles de temps et la concentration d'insuline a été déterminée par HPLC.
Le comportement de libération in vitro de nanoparticules d'insuline fraîchement préparées et déshydratées a été testé par la méthode de dialyse (seuil de coupure de 100 kDa, Spectra Por Inc.). Les nanoparticules sèches, fraîchement préparées et reconstituées, ont été dialysées dans des solutions à pH 2,5, 6,6 et 7,0 (solution saline tamponnée au phosphate 0,1 M, PBS) afin de simuler respectivement le pH de l'estomac, du duodénum et de la partie supérieure de l'intestin grêle. Tous les échantillons ont été incubés à 37 °C sous agitation continue à 200 tr/min. Le liquide a été aspiré hors de la poche de dialyse de 5 mL aux temps suivants : 0,5, 1, 2, 3, 4 et 6 h, et le volume a été immédiatement remplacé par du dialysat frais. La contamination du liquide par l'insuline a été analysée par HPLC, et la vitesse de libération de l'insuline à partir des nanoparticules a été calculée à partir du rapport entre l'insuline libre libérée et l'insuline totale encapsulée dans les nanoparticules (Équation). 3).
Les cellules HepG2, lignée cellulaire de carcinome hépatocellulaire humain, ont été cultivées dans des boîtes de Petri de 60 mm de diamètre dans du milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) contenant 10 % de sérum de veau fœtal, 100 UI/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine²⁹. Les cultures ont été maintenues à 37 °C, 95 % d'humidité relative et 5 % de CO₂. Pour les tests d'internalisation, les cellules HepG2 ont été ensemencées à une densité de 1 × 10⁵ cellules/mL dans un système de lames à chambres Nunc Lab-Tek à 8 puits (Thermo Fisher, NY, États-Unis). Pour les tests de cytotoxicité, elles ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits (Corning, NY, États-Unis) à une densité de 5 × 10⁴ cellules/mL.
Le test MTT a été utilisé pour évaluer la cytotoxicité de nanoparticules d'insuline (NPs) fraîchement préparées et déshydratées. Des cellules HepG2 ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à une densité de 5 × 10⁴ cellules/mL et cultivées pendant 7 jours avant le test. Les NPs d'insuline ont été diluées à différentes concentrations (50 à 500 μg/mL) dans le milieu de culture, puis administrées aux cellules. Après 24 heures d'incubation, les cellules ont été lavées 3 fois avec du PBS et incubées dans un milieu contenant 0,5 mg/mL de MTT pendant 4 heures supplémentaires. La cytotoxicité a été évaluée en mesurant la réduction enzymatique du tétrazolium MTT jaune en formazan violet à 570 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques spectrophotométrique Tecan Infinite M200 Pro (Tecan, Männedorf, Suisse).
L'efficacité d'internalisation cellulaire des nanoparticules (NP) a été testée par microscopie confocale à balayage laser et par cytométrie en flux. Chaque puits du système de lames à chambres Nunc Lab-Tek a été traité avec de l'insuline FITC libre, des NP chargées en insuline FITC et des NP d'insuline FITC déshydratées reconstituées à une concentration de 25 μg/mL, puis incubé pendant 4 heures. Les cellules ont été lavées 3 fois avec du PBS et fixées avec du paraformaldéhyde à 4 %. Les noyaux ont été colorés au DAPI (4′,6-diamidino-2-phénylindole). La localisation de l'insuline a été observée à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser/biphotonique Olympus FV1000 (Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japon). Pour l'analyse par cytométrie en flux, les mêmes concentrations (10 μg/mL) d'insuline FITC libre, de NP chargées en insuline FITC et de NP d'insuline FITC reconstituées ont été utilisées. Des nanoparticules d'insuline FITC déshydratées ont été ajoutées à des plaques à 96 puits ensemencées avec des cellules HepG2 et incubées pendant 4 heures. Après 4 h d'incubation, les cellules ont été retirées et lavées 3 fois avec du FBS. 5 × 10⁴ cellules par échantillon ont été analysées par un cytomètre de flux BD LSR II (BD, Franklin Lakes, New Jersey, États-Unis).
Toutes les valeurs sont exprimées sous forme de moyenne ± écart-type. Les comparaisons entre tous les groupes ont été évaluées à l'aide d'une ANOVA à un facteur ou d'un test t par IBM SPSS Statistics 26 pour Mac (IBM, Endicott, New York, États-Unis) et p < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.
Cette étude démontre la flexibilité et l'efficacité de la pulvérisation pour déshydrater des nanoparticules de chitosane/TPP/insuline réticulées, avec une meilleure reconstitution que les méthodes de lyophilisation classiques utilisant des agents de charge ou des cryoprotecteurs, ainsi qu'une capacité de chargement supérieure. Les nanoparticules d'insuline optimisées présentent une taille moyenne de 318 nm et une efficacité d'encapsulation de 99,4 %. Les analyses MEB et FTIR après déshydratation montrent que la structure sphérique est conservée uniquement dans les nanoparticules pulvérisées avec ou sans mannitol et lyophilisées avec mannitol, tandis que les nanoparticules lyophilisées sans mannitol se décomposent lors de la déshydratation. Lors du test de reconstitution, les nanoparticules d'insuline pulvérisées sans mannitol présentent la plus petite taille moyenne et le chargement le plus élevé après reconstitution. L'étude de la cinétique de libération de ces nanoparticules déshydratées révèle une libération rapide dans des solutions de pH 2,5 et 7, et une grande stabilité dans une solution de pH 6,5. Comparées à d'autres nanoparticules redissoutes… Parmi les nanoparticules déshydratées, celles séchées par atomisation sans mannitol ont présenté la libération la plus rapide. Ce résultat est cohérent avec celui observé lors du test d'absorption cellulaire, les nanoparticules séchées par atomisation en l'absence de mannitol conservant presque intégralement l'efficacité d'absorption cellulaire des nanoparticules fraîchement préparées. Ces résultats suggèrent que les nanoparticules d'insuline sèches préparées par séchage par atomisation sans mannitol sont les plus adaptées à la fabrication d'autres formes galéniques anhydres, telles que des comprimés oraux ou des films bioadhésifs.
En raison de problèmes de propriété intellectuelle, les ensembles de données générés et/ou analysés au cours de la présente étude ne sont pas accessibles au public, mais peuvent être obtenus auprès des auteurs respectifs sur demande raisonnable.
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