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L'acide propionique (PPA) est utilisé pour étudier le rôle du dysfonctionnement mitochondrial dans les troubles neurodéveloppementaux tels que les troubles du spectre autistique. Le PPA est connu pour perturber la biogenèse, le métabolisme et le renouvellement mitochondrial. Cependant, ses effets sur la dynamique, la fission et la fusion mitochondriales restent difficiles à élucider en raison de la complexité temporelle de ces mécanismes. Dans cette étude, nous utilisons des techniques d'imagerie quantitative complémentaires pour examiner comment le PPA affecte l'ultrastructure, la morphologie et la dynamique mitochondriales dans des cellules SH-SY5Y, un modèle neuronal. Le PPA (5 mM) a induit une diminution significative de la surface mitochondriale (p < 0,01), du diamètre et de la circonférence de Feret (p < 0,05), ainsi que de l'aire 2 (p < 0,01). L'analyse par localisation d'événements mitochondriaux a révélé une augmentation significative (p < 0,05) des événements de fission et de fusion, maintenant ainsi l'intégrité du réseau mitochondrial en conditions de stress. De plus, l'expression des ARNm de cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) et OPA1 (p < 0,05) était significativement réduite. Ceci illustre le remodelage de la morphologie, de la biogenèse et de la dynamique mitochondriales nécessaire au maintien de la fonction mitochondriale en conditions de stress. Nos données apportent un nouvel éclairage sur les effets du PPA sur la dynamique mitochondriale et soulignent l'intérêt des techniques d'imagerie pour l'étude des mécanismes de régulation complexes impliqués dans les réponses au stress mitochondrial.
Les mitochondries participent activement à de nombreuses fonctions cellulaires, au-delà de leur rôle habituel dans la production d'énergie et la biosynthèse. Le métabolisme mitochondrial est un régulateur clé de la signalisation calcique, de l'homéostasie métabolique et redox, de la signalisation inflammatoire, des modifications épigénétiques, de la prolifération cellulaire, de la différenciation et de la mort cellulaire programmée¹. En particulier, il est essentiel au développement, à la survie et au fonctionnement des neurones et est largement impliqué dans diverses manifestations de neuropathologies^2,3,4.
Au cours de la dernière décennie, le statut métabolique est apparu comme un régulateur central de la neurogenèse, de la différenciation, de la maturation et de la plasticité neuronales^5,6. Récemment, la morphologie et la dynamique mitochondriales sont devenues des composantes particulièrement importantes de la mitose, un processus dynamique qui maintient un pool de mitochondries saines au sein des cellules. La dynamique mitochondriale est régulée par des voies complexes et interdépendantes, allant de la biogenèse et de la bioénergétique mitochondriales à la fission, la fusion, le transport et l'élimination des mitochondries^7,8. La perturbation de l'un de ces mécanismes d'intégration compromet le maintien de réseaux mitochondriaux sains et a des conséquences fonctionnelles profondes sur le neurodéveloppement^9,10. En effet, une dérégulation de la dynamique mitochondriale est observée dans de nombreux troubles psychiatriques, neurodégénératifs et neurodéveloppementaux, notamment les troubles du spectre autistique (TSA)^11,12.
Les troubles du spectre autistique (TSA) constituent un trouble neurodéveloppemental hétérogène, caractérisé par une architecture génétique et épigénétique complexe. L'hérédité des TSA est incontestable, mais leur étiologie moléculaire sous-jacente demeure mal comprise. L'accumulation de données issues de modèles précliniques, d'études cliniques et d'analyses moléculaires multi-omiques apporte des preuves croissantes d'un dysfonctionnement mitochondrial dans les TSA^13,14. Nous avons précédemment réalisé un criblage de la méthylation de l'ADN à l'échelle du génome dans une cohorte de patients atteints de TSA et identifié des gènes différentiellement méthylés, regroupés le long des voies métaboliques mitochondriales¹⁵. Nous avons ensuite rapporté une méthylation différentielle de régulateurs centraux de la biogenèse et de la dynamique mitochondriales, associée à une augmentation du nombre de copies d'ADNmt et à une altération du profil métabolique urinaire dans les TSA¹⁶. Nos données confirment que la dynamique et l'homéostasie mitochondriales jouent un rôle central dans la physiopathologie des TSA. Par conséquent, l’amélioration de la compréhension mécanistique de la relation entre la dynamique, la morphologie et la fonction mitochondriales est un objectif clé des recherches en cours sur les maladies neurologiques caractérisées par un dysfonctionnement mitochondrial secondaire.
Les techniques moléculaires sont fréquemment utilisées pour étudier le rôle de gènes spécifiques dans les réponses au stress mitochondrial. Cependant, cette approche peut être limitée par la nature multifactorielle et temporelle des mécanismes de contrôle mitotique. De plus, l'expression différentielle des gènes mitochondriaux est un indicateur indirect des changements fonctionnels, d'autant plus que seul un nombre limité de gènes est généralement analysé. C'est pourquoi des méthodes plus directes d'étude de la fonction et de la bioénergétique mitochondriales ont été proposées¹⁷. La morphologie mitochondriale est étroitement liée à la dynamique mitochondriale. La forme, la connectivité et la structure des mitochondries sont essentielles à la production d'énergie et à la survie des mitochondries et des cellules^5,18. Par ailleurs, les différents composants de la mitose se concentrent sur les modifications de la morphologie mitochondriale, qui peuvent constituer des critères d'évaluation pertinents du dysfonctionnement mitochondrial et fournir une base pour des études mécanistiques ultérieures.
La morphologie mitochondriale peut être observée directement par microscopie électronique à transmission (MET), permettant une étude détaillée de l'ultrastructure cellulaire. La MET visualise directement la morphologie, la forme et la structure des crêtes mitochondriales à l'échelle de la mitochondrie individuelle, contrairement aux techniques qui reposent uniquement sur la transcription génique, l'expression protéique ou les paramètres fonctionnels mitochondriaux dans des populations cellulaires^17,19,20. De plus, la MET facilite l'étude des interactions entre les mitochondries et d'autres organites, tels que le réticulum endoplasmique et les autophagosomes, qui jouent un rôle clé dans la fonction et l'homéostasie mitochondriales^21,22. Ainsi, la MET constitue un excellent point de départ pour l'étude des dysfonctionnements mitochondriaux avant de se concentrer sur des voies de signalisation ou des gènes spécifiques. La fonction mitochondriale étant de plus en plus importante en neuropathologie, il est essentiel de pouvoir étudier directement et quantitativement la morphologie et la dynamique mitochondriales dans des modèles neuronaux in vitro.
Dans cet article, nous examinons la dynamique mitochondriale dans un modèle neuronal de dysfonctionnement mitochondrial associé aux troubles du spectre autistique (TSA). Nous avons précédemment rapporté une méthylation différentielle de la propionyl-CoA carboxylase bêta (PCCB) dans le modèle ASD15, une sous-unité de l'enzyme mitochondriale PCC, également appelée propionyl-CoA carboxylase. On sait que le dérèglement de la PCC entraîne une accumulation toxique de dérivés propioniques, notamment l'acide propionique (PPA)^23,24,25. Il a été démontré que le PPA perturbe le métabolisme neuronal et modifie le comportement in vivo ; il constitue un modèle animal établi pour l'étude des mécanismes neurodéveloppementaux impliqués dans les TSA^26,27,28. De plus, il a été rapporté que le PPA perturbe le potentiel membranaire mitochondrial, la biogenèse et la respiration mitochondriales in vitro et qu'il est largement utilisé pour modéliser le dysfonctionnement mitochondrial dans les neurones^29,30. Cependant, l'impact du dysfonctionnement mitochondrial induit par le PPA sur la morphologie et la dynamique mitochondriales reste mal compris.
Cette étude utilise des techniques d'imagerie complémentaires pour quantifier les effets du PPA sur la morphologie, la dynamique et la fonction mitochondriales dans les cellules SH-SY5Y. Nous avons d'abord développé une méthode de microscopie électronique à transmission (MET) pour visualiser les modifications de la morphologie et de l'ultrastructure mitochondriales^17,31,32. Compte tenu de la nature dynamique des mitochondries³³, nous avons également utilisé l'analyse MEL (Mitochondrial Event Localizer) pour quantifier les variations de l'équilibre entre fission et fusion mitochondriales, ainsi que le nombre et le volume des mitochondries sous l'effet du stress induit par le PPA. Enfin, nous avons examiné si la morphologie et la dynamique mitochondriales sont associées à des modifications de l'expression des gènes impliqués dans la biogenèse, la fission et la fusion. L'ensemble de nos données illustre la complexité des mécanismes régulant la dynamique mitochondriale. Nous soulignons l'intérêt de la MET pour l'étude de la morphologie mitochondriale en tant que marqueur convergent et mesurable de la mitose dans les cellules SH-SY5Y. De plus, nous soulignons que les données de microscopie électronique à transmission (MET) fournissent les informations les plus complètes lorsqu'elles sont combinées à des techniques d'imagerie permettant également de saisir les événements dynamiques en réponse au stress métabolique. Une caractérisation plus poussée des mécanismes de régulation moléculaire qui sous-tendent la mitose des cellules neuronales pourrait apporter un éclairage important sur la composante mitochondriale du système nerveux et des maladies neurodégénératives.
Pour induire un stress mitochondrial, des cellules SH-SY5Y ont été traitées avec du PPA à des concentrations de 3 mM et 5 mM de propionate de sodium (NaP). Avant l'observation au MET, les échantillons ont été cryoconservés par congélation à haute pression (Fig. 1a). Nous avons développé un pipeline automatisé d'analyse d'images mitochondriales permettant de mesurer huit paramètres morphologiques des populations mitochondriales sur trois réplicats biologiques. Nous avons constaté que le traitement au PPA modifiait significativement quatre paramètres : la surface 2, la surface, le périmètre et le diamètre de Feret (Fig. 1b–e). La surface 2 a diminué significativement avec les deux concentrations de PPA (3 mM et 5 mM, p = 0,0183 et p = 0,002, respectivement) (Fig. 1b), tandis que la surface (p = 0,003), le périmètre (p = 0,0106) et le diamètre de Feret ont tous diminué significativement. On a observé une réduction significative (p = 0,0172) dans le groupe traité avec 5 mM de PPA par rapport au groupe témoin (Fig. 1c–e). Les réductions significatives de la surface et de la circonférence ont montré que les cellules traitées avec 5 mM de PPA présentaient des mitochondries plus petites et plus arrondies, et que ces mitochondries étaient moins allongées que celles des cellules témoins. Ceci est également cohérent avec une diminution significative du diamètre de Feret, un paramètre indépendant indiquant une diminution de la distance maximale entre les bords des particules. Des modifications de l'ultrastructure des crêtes ont été observées : les crêtes sont devenues moins prononcées sous l'effet du stress induit par le PPA (Fig. 1a, panneau B). Cependant, toutes les images ne reflétaient pas clairement l'ultrastructure des crêtes, de sorte qu'une analyse quantitative de ces modifications n'a pas été réalisée. Ces données de MET peuvent refléter trois scénarios possibles : (1) le PPA favorise la fission ou inhibe la fusion, entraînant une diminution de la taille des mitochondries existantes ; (2) une biogenèse accrue crée de nouvelles mitochondries plus petites ou (3) induit simultanément les deux mécanismes. Bien que ces conditions ne puissent être distinguées par MET, des modifications morphologiques significatives indiquent des altérations de l'homéostasie et de la dynamique mitochondriales sous stress PPA. Nous avons ensuite exploré d'autres paramètres afin de mieux caractériser ces dynamiques et les mécanismes potentiels sous-jacents.
L'acide propionique (PPA) remodèle la morphologie mitochondriale. (a) Images représentatives de microscopie électronique à transmission (MET) montrant que la taille des mitochondries diminue et que celles-ci deviennent plus petites et plus arrondies avec l'augmentation de la concentration de PPA : 0 mM (non traité), 3 mM et 5 mM, respectivement. Les flèches rouges indiquent les mitochondries. (b–e) Des cellules SH-SY5Y traitées au PPA pendant 24 h ont été préparées pour la MET et les résultats ont été analysés à l'aide de Fiji/ImageJ. Quatre des huit paramètres ont montré des différences significatives entre les cellules témoins (non traitées, 0 mM de PPA) et les cellules traitées (3 mM et 5 mM de PPA). (b) Région 2, (c) Aire, (d) Périmètre, (e) Diamètre de Feret. Une analyse de variance à un facteur (témoin vs. traitement) et le test de comparaisons multiples de Dunnett ont été utilisés pour déterminer les différences significatives (p < 0,05). Les points représentent la valeur mitochondriale moyenne de chaque cellule, et les barres d'erreur représentent la moyenne ± l'erreur standard à la moyenne (SEM). Les données présentées correspondent à n = 3, avec au moins 24 cellules par réplicat ; un total de 266 images ont été analysées ; * indique p < 0,05, ** indique p < 0,01.
Afin de mieux caractériser la réponse de la dynamique mitochondriale au PPA, nous avons coloré les mitochondries avec de l'ester éthylique de tétraméthylrhodamine (TMRE) et utilisé la microscopie à intervalles réguliers et l'analyse MEL pour localiser et quantifier les mitochondries après 24 heures de traitement à 3 et 5 mM de PPA. Ce traitement induit des événements de fission et de fusion (Fig. 2a). Après analyse MEL, les mitochondries ont été analysées plus en détail afin de quantifier le nombre de structures mitochondriales et leur volume moyen. Nous avons observé une augmentation faible mais significative du nombre d'événements de fission à 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] par rapport au contrôle. Le nombre d'événements de fission [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)] et de fusion [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] était significativement augmenté à 5 mM par rapport au contrôle (Fig. 3b). Le nombre de mitochondries a augmenté significativement à la fois à 3 mM [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] et à 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Fig. 3c), tandis que le volume moyen de chaque structure mitochondriale est resté inchangé (Fig. 3d). L'ensemble de ces résultats suggère que le remodelage de la dynamique mitochondriale constitue une réponse compensatoire qui maintient l'intégrité du réseau mitochondrial. L'augmentation du nombre de fissions à 3 mM de PPA suggère que l'accroissement du nombre de mitochondries est en partie dû à la fission mitochondriale. Cependant, étant donné que le volume mitochondrial moyen reste sensiblement inchangé, la biogenèse ne peut être exclue comme réponse compensatoire supplémentaire. Néanmoins, ces données concordent avec les structures mitochondriales plus petites et arrondies observées par MET et démontrent également des modifications significatives de la dynamique mitochondriale induites par le PPA.
L'acide propionique (PPA) induit un remodelage mitochondrial dynamique pour maintenir l'intégrité du réseau. Des cellules SH-SY5Y ont été cultivées, traitées avec 3 et 5 mM de PPA pendant 24 heures, puis colorées au TMRE et au Hoechst 33342 avant analyse par MEL. (a) Images représentatives de microscopie en temps réel montrant les projections d'intensité maximale (MIP) en couleur et binarisées au temps 2 (t2) pour chaque condition. Les régions sélectionnées, indiquées sur chaque image binaire, sont agrandies et affichées en 3D à trois instants différents (t1-t3) pour illustrer la dynamique au cours du temps ; les événements de fusion sont mis en évidence en vert ; les événements de fission sont mis en évidence en rouge. (b) Nombre moyen d'événements dynamiques par condition. (c) Nombre moyen de structures mitochondriales par cellule. (d) Volume moyen (µm³) de chaque structure mitochondriale par cellule. Les données présentées sont représentatives de n = 15 cellules par groupe de traitement. Les barres d'erreur affichées représentent la moyenne ± l'erreur standard de la moyenne (SEM), échelle = 10 μm, * p < 0,05.
L'acide propionique (PPA) induit une répression transcriptionnelle des gènes impliqués dans la dynamique mitochondriale. Des cellules SH-SY5Y ont été traitées avec du PPA à 3 et 5 mM pendant 24 h. La quantification relative de l'expression génique a été réalisée par RT-qPCR et normalisée par rapport à la β2-microglobuline (B2M). Gènes de la biogenèse mitochondriale : (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 et (d) NFE2L2. Gènes de la fusion et de la fission mitochondriales : (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 et (i) DRP1. Les différences significatives (p < 0,05) ont été analysées par ANOVA à un facteur (contrôle vs traitement) et par le test de comparaisons multiples de Dunnett : * indique p < 0,05, ** indique p < 0,01 et **** indique p < 0,0001. Les barres représentent l'expression moyenne ± l'erreur standard à la moyenne (SEM). Les données présentées représentent n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) et n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) réplicats biologiques.
Les données issues des analyses TEM et MEL indiquent conjointement que le PPA modifie la morphologie et la dynamique mitochondriales. Cependant, ces techniques d'imagerie ne permettent pas d'élucider les mécanismes sous-jacents. Nous avons donc examiné l'expression des ARNm de neuf régulateurs clés de la dynamique, de la biogenèse et de la mitose mitochondriales en réponse à un traitement au PPA. Nous avons quantifié l'oncogène du myélome multiple (cMYC), le facteur respiratoire nucléaire 1 (NRF1), le facteur de transcription mitochondrial 1 (TFAM), le facteur de transcription NFE2L2, la protéine STOML2, l'atrophie du nerf optique 1 (OPA1), la mitofusine 1 (MFN1), la mitofusine 2 (MFN2) et la protéine 1 apparentée à la dynamine (DRP1) après 24 heures de traitement avec du PPA à des concentrations de 3 mM et 5 mM. Nous avons observé des effets significatifs du traitement par PPA à 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 et p < 0,0001, respectivement) et à 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233 et p < 0,0001) (Fig. 3a–c). La diminution de l'expression des ARNm était dose-dépendante : l'expression de cMYC, NRF1 et TFAM a diminué respectivement de 5,7, 2,6 et 1,9 fois à 3 mM, et de 11,2, 3 et 2,2 fois à 5 mM. En revanche, l'expression du gène central de la biogenèse redox NFE2L2 n'a pas été modifiée, quelle que soit la concentration de PPA, bien qu'une diminution d'expression dose-dépendante similaire ait été observée (Fig. 3d).
Nous avons également examiné l'expression des gènes classiques impliqués dans la régulation de la fission et de la fusion. STOML2, impliqué dans la fusion, la mitophagie et la biogenèse, présente une expression significativement réduite (p < 0,0001) par le PPA à 3 mM (diminution de 2,4 fois) et à 5 mM (diminution de 2,8 fois) (Fig. 1d). De même, l'expression du gène de fusion OPA1 diminue à 3 mM (diminution de 1,6 fois) et à 5 mM (diminution de 1,9 fois) de PPA (p = 0,006 et p = 0,0024, respectivement) (Fig. 3f). En revanche, aucune différence significative n'est observée dans l'expression des gènes de fusion MFN1 et MFN2, ni du gène de fission DRP1, après 24 h de stress induit par le PPA (Fig. 3g–i). De plus, nous avons constaté que les niveaux de quatre protéines de fusion et de fission (OPA1, MFN1, MFN2 et DRP1) restaient inchangés dans les mêmes conditions (Fig. 4a–d). Il est important de noter que ces données correspondent à un instant précis et pourraient ne pas refléter les variations d'expression ou d'activité des protéines au cours des premières phases du stress induit par le PPA. Cependant, la diminution significative de l'expression de cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 et OPA1 indique une importante dérégulation transcriptionnelle du métabolisme, de la biogenèse et de la dynamique mitochondriaux. Par ailleurs, ces données soulignent l'intérêt des techniques d'imagerie pour étudier directement les modifications de la fonction mitochondriale à l'état final.
Les niveaux de protéines des facteurs de fusion et de fission sont restés inchangés après traitement à l'acide propionique (PPA). Les cellules SH-SY5Y ont été traitées avec 3 et 5 mM de PPA pendant 24 h. Les niveaux de protéines ont été quantifiés par Western blot et normalisés par rapport aux protéines totales. L'expression protéique moyenne et des Western blots représentatifs des protéines cibles et totales sont présentés. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Les barres représentent la moyenne ± l'erreur standard à la moyenne (SEM) et les données présentées sont représentatives de n = 3 réplicats biologiques. Des comparaisons multiples (p < 0,05) ont été réalisées par analyse de variance à un facteur (ANOVA) et test de Dunnett. Le gel et le Western blot originaux sont présentés dans la figure S1.
Les dysfonctionnements mitochondriaux sont associés à des maladies multisystémiques, allant des maladies métaboliques, cardiovasculaires et musculaires aux maladies neurologiques^1,10. De nombreuses maladies neurodégénératives sont liées à ces dysfonctionnements, soulignant l'importance de ces organites tout au long du développement cérébral. Parmi ces maladies figurent la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer et les troubles du spectre autistique (TSA)^3,4,18. Cependant, l'accès aux tissus cérébraux pour étudier ces maladies est difficile, notamment au niveau mécanistique, ce qui rend les modèles cellulaires indispensables. Dans cette étude, nous utilisons un modèle cellulaire composé de cellules SH-SY5Y traitées au PPA pour reproduire les dysfonctionnements mitochondriaux observés dans les maladies neuronales, en particulier les TSA. L'utilisation de ce modèle PPA pour étudier la dynamique mitochondriale dans les neurones pourrait apporter un éclairage nouveau sur l'étiologie des TSA.
Nous avons exploré la possibilité d'utiliser la microscopie électronique à transmission (MET) pour observer les modifications de la morphologie mitochondriale. Il est important de noter que la MET doit être utilisée correctement pour optimiser son efficacité. La préparation d'échantillons cryogéniques permet une meilleure préservation des structures neuronales en fixant simultanément les composants cellulaires et en réduisant la formation d'artefacts³⁴. Conformément à cela, nous avons observé que les cellules SH-SY5Y, de type neuronal, présentaient des organites subcellulaires intacts et des mitochondries allongées (Fig. 1a). Ceci souligne l'utilité des techniques de préparation cryogénique pour l'étude de la morphologie mitochondriale dans des modèles de cellules neuronales. Bien que les mesures quantitatives soient essentielles à une analyse objective des données MET, il n'existe toujours pas de consensus sur les paramètres spécifiques à mesurer pour confirmer les modifications morphologiques mitochondriales. En nous appuyant sur de nombreuses études ayant examiné quantitativement la morphologie mitochondriale^17,31,32, nous avons développé un pipeline automatisé d'analyse d'images mitochondriales qui mesure huit paramètres morphologiques : la surface, la surface², le rapport d'aspect, le périmètre, la circularité, le degré de courbure et le diamètre de Feret. et la rondeur.
Parmi ces caractéristiques, le PPA a significativement réduit la surface, le périmètre et le diamètre de Feret (Fig. 1b–e). Ceci indique que les mitochondries sont devenues plus petites et plus arrondies, ce qui concorde avec des études antérieures montrant une diminution de la surface mitochondriale après 72 heures de stress mitochondrial induit par le PPA30. Ces caractéristiques morphologiques pourraient indiquer une fission mitochondriale, un processus nécessaire pour isoler les composants endommagés du réseau mitochondrial et favoriser leur dégradation par mitophagie^35,36,37. Par ailleurs, la diminution de la taille moyenne des mitochondries pourrait être associée à une augmentation de la biogenèse, entraînant la formation de petites mitochondries naissantes. L'augmentation de la fission ou de la biogenèse représente une réponse compensatoire visant à maintenir la mitose face au stress mitochondrial. Cependant, une diminution de la croissance mitochondriale, une fusion altérée ou d'autres facteurs ne peuvent être exclus.
Bien que les images haute résolution obtenues par MET permettent de déterminer les caractéristiques morphologiques des mitochondries individuelles, cette méthode ne produit que des instantanés bidimensionnels à un instant précis. Afin d'étudier les réponses dynamiques au stress métabolique, nous avons coloré les mitochondries au TMRE et utilisé la microscopie à intervalles réguliers couplée à l'analyse MEL, permettant une visualisation 3D à haut débit des modifications du réseau mitochondrial au cours du temps^33,38. Nous avons observé des modifications subtiles mais significatives de la dynamique mitochondriale sous stress induit par le PPA (Fig. 2). À 3 mM, le nombre d'événements de fission a augmenté significativement, tandis que le nombre d'événements de fusion est resté identique à celui du contrôle. Une augmentation du nombre d'événements de fission et de fusion a été observée à 5 mM de PPA, mais ces variations étaient approximativement proportionnelles, suggérant que les cinétiques de fission et de fusion atteignent un équilibre à des concentrations plus élevées (Fig. 2b). Le volume mitochondrial moyen est resté inchangé à des concentrations de PPA de 3 et 5 mM, indiquant que l'intégrité du réseau mitochondrial était préservée (Fig. 2d). Ceci reflète la capacité des réseaux mitochondriaux dynamiques à répondre à un stress métabolique modéré afin de maintenir efficacement l'homéostasie sans fragmentation du réseau. À 3 mM de PPA, l'augmentation de la fission est suffisante pour favoriser la transition vers un nouvel équilibre, mais un remodelage cinétique plus important est nécessaire en réponse au stress induit par des concentrations plus élevées de PPA.
Le nombre de mitochondries a augmenté aux deux concentrations de stress induites par le PPA, mais le volume mitochondrial moyen n'a pas varié significativement (Fig. 2c). Ceci pourrait être dû à une augmentation de la biogenèse ou de la division mitochondriale ; cependant, en l'absence de diminution significative du volume mitochondrial moyen, l'augmentation de la biosynthèse est plus probable. Néanmoins, les données de la figure 2 confirment l'existence de deux mécanismes compensatoires : une augmentation du nombre de fissions, compatible avec une stimulation de la fission mitochondriale, et une augmentation du nombre de divisions, compatible avec une biogenèse mitochondriale. En définitive, la compensation dynamique d'un stress modéré pourrait impliquer des processus simultanés de fission, de fusion, de biogenèse et de mitophagie. Bien que des études antérieures aient montré que le PPA stimule la mitose^30,39 et la mitophagie²⁹, nous apportons la preuve d'un remodelage de la dynamique de fission et de fusion mitochondriales en réponse au PPA. Ces données confirment les changements morphologiques observés par MET et apportent un éclairage supplémentaire sur les mécanismes associés au dysfonctionnement mitochondrial induit par le PPA.
Comme ni la microscopie électronique à transmission (MET) ni l'analyse par microscopie électronique à balayage (MEB) n'ont fourni de preuve directe des mécanismes de régulation génique sous-jacents aux modifications morphologiques observées, nous avons examiné l'expression des ARN des gènes impliqués dans le métabolisme, la biogenèse et la dynamique mitochondriaux. Le proto-oncogène cMYC est un facteur de transcription impliqué dans la régulation des mitochondries, de la glycolyse et du métabolisme des acides aminés et des acides gras⁴⁰. De plus, cMYC est connu pour réguler l'expression de près de 600 gènes mitochondriaux impliqués dans la transcription, la traduction et l'assemblage des complexes mitochondriaux, notamment NRF1 et TFAM⁴¹. NRF1 et TFAM sont deux régulateurs centraux de la mitose, agissant en aval de PGC-1α pour activer la réplication de l'ADNmt. Cette voie est activée par la signalisation de l'AMPc et de l'AMPK et est sensible à la dépense énergétique et au stress métabolique. Nous avons également examiné NFE2L2, un régulateur redox de la biogenèse mitochondriale, afin de déterminer si les effets du PPA pouvaient être médiés par le stress oxydatif.
Bien que l'expression de NFE2L2 soit restée inchangée, nous avons observé une diminution dose-dépendante et constante de l'expression de cMYC, NRF1 et TFAM après 24 h de traitement avec 3 mM et 5 mM de PPA (Fig. 3a–c). La diminution de l'expression de cMYC a déjà été décrite comme une réponse au stress mitochondrial⁴² et, inversement, elle peut induire un dysfonctionnement mitochondrial en remodelant le métabolisme mitochondrial, la connectivité du réseau et la polarisation membranaire⁴³. De manière intéressante, cMYC est également impliqué dans la régulation de la fission et de la fusion mitochondriales^42,43 et est connu pour augmenter la phosphorylation de DRP1 et sa localisation mitochondriale lors de la division cellulaire⁴⁴, ainsi que pour moduler le remodelage morphologique mitochondrial dans les cellules souches neuronales⁴⁵. En effet, les fibroblastes déficients en cMYC présentent une taille mitochondriale réduite, ce qui concorde avec les modifications induites par le stress au PPA⁴³. Ces données illustrent une relation intéressante mais encore floue entre cMYC et la dynamique mitochondriale, offrant une cible intéressante pour de futures études sur le remodelage induit par le stress PPA.
La réduction de NRF1 et de TFAM est cohérente avec le rôle de cMYC en tant qu'activateur transcriptionnel important. Ces données concordent également avec des études antérieures menées sur des cellules de cancer du côlon humain, montrant que le PPA réduit l'expression de l'ARNm de NRF1 après 22 heures, ce qui est associé à une déplétion d'ATP et à une augmentation de ROS46. Ces auteurs ont également rapporté que l'expression de TFAM augmente après 8,5 heures, puis revient à son niveau basal après 22 heures. En revanche, Kim et al. (2019) ont montré que l'expression de l'ARNm de TFAM diminue significativement après 4 heures de stress induit par le PPA dans les cellules SH-SY5Y ; cependant, après 72 heures, l'expression de la protéine TFAM et le nombre de copies d'ADNmt augmentent significativement. Ainsi, la diminution du nombre de gènes de la biogenèse mitochondriale que nous avons observée après 24 heures n'exclut pas la possibilité que l'augmentation du nombre de mitochondries soit associée à une activation de la biogenèse à des temps plus précoces. Des études antérieures ont montré que le PPA induit une forte surexpression de l'ARNm et de la protéine PGC-1α dans les cellules SH-SY5Y après 4 heures et 30 minutes, tandis que l'acide propionique stimule la biogenèse mitochondriale dans les hépatocytes de veau via PGC-1α après 12 heures et 39 minutes. Il est intéressant de noter que PGC-1α n'est pas seulement un régulateur transcriptionnel direct de NRF1 et TFAM, mais qu'il régule également l'activité de MFN2 et DRP1 en contrôlant la fission et la fusion mitochondriales⁴⁷. L'ensemble de ces résultats souligne le couplage étroit des mécanismes régulant les réponses compensatoires mitochondriales induites par le PPA. De plus, nos données révèlent une dérégulation significative de la régulation transcriptionnelle de la biogenèse et du métabolisme mitochondriaux en conditions de stress induit par le PPA.
Les gènes STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 et DRP1 figurent parmi les régulateurs centraux de la fission, de la fusion et de la dynamique mitochondriales^37,48,49. De nombreux autres gènes sont impliqués dans la dynamique mitochondriale ; cependant, il a été précédemment démontré que STOML2, OPA1 et MFN2 présentent une méthylation différentielle dans des cohortes de patients atteints de TSA¹⁶, et plusieurs études indépendantes ont rapporté des modifications de ces facteurs de transcription en réponse au stress mitochondrial^50,51,52. L’expression d’OPA1 et de STOML2 a été significativement réduite par un traitement au PPA à 3 mM et 5 mM (Fig. 3e, f). OPA1 est l’un des régulateurs classiques de la fusion mitochondriale par interaction directe avec MFN1 et 2 et joue un rôle dans le remodelage des crêtes mitochondriales et la morphologie mitochondriale⁵³. Le rôle précis de STOML2 dans la dynamique mitochondriale reste flou, mais des preuves suggèrent qu'il joue un rôle dans la fusion mitochondriale, la biogenèse et la mitophagie.
STOML2 participe au maintien du couplage respiratoire mitochondrial et à la formation des complexes de la chaîne respiratoire^54,55 et il a été démontré qu'il modifie profondément les caractéristiques métaboliques des cellules cancéreuses⁵⁶. Des études ont montré que STOML2 favorise le potentiel membranaire mitochondrial et la biogenèse par interaction avec BAN et la cardiolipine^55,57,58. De plus, des études indépendantes ont montré que l'interaction entre STOML2 et PINK1 régule la mitophagie^59,60. Notamment, il a été rapporté que STOML2 interagit directement avec MFN2 et le stabilise, et joue également un rôle important dans la stabilisation des isoformes longues d'OPA1 en inhibant la protéase responsable de la dégradation d'OPA1^53,61,62. La réduction de l'expression de STOML2 observée dans les réactions PPA pourrait rendre ces protéines de fusion plus sensibles à la dégradation par les voies dépendantes de l'ubiquitine et du protéasome⁴⁸. Bien que le rôle précis de STOML2 et OPA1 dans la réponse dynamique au PPA ne soit pas clair, une diminution de l'expression de ces gènes de fusion (Figure 3) peut perturber l'équilibre entre la fission et la fusion et conduire à une diminution de la taille des mitochondries (Figure 3). 1).
En revanche, l'expression de la protéine OPA1 est restée inchangée après 24 h, tandis que les niveaux d'ARNm et de protéines de MFN1, MFN2 ou DRP1 n'ont pas varié significativement après le traitement au PPA (Fig. 3g-i, Fig. 4). Ceci suggère l'absence de modification de la régulation de ces facteurs impliqués dans la fusion et la fission mitochondriales. Il convient toutefois de noter que chacun de ces quatre gènes est également régulé par des modifications post-transcriptionnelles (MPT) qui contrôlent l'activité protéique. OPA1 possède huit variants d'épissage alternatifs qui sont clivés par protéolyse dans les mitochondries pour produire deux isoformes distinctes⁶³. L'équilibre entre les isoformes longues et courtes détermine le rôle d'OPA1 dans la fusion mitochondriale et le maintien du réseau mitochondrial⁶⁴. L'activité de DRP1 est régulée par la phosphorylation de la protéine kinase II dépendante du calcium/calmoduline (CaMKII), tandis que sa dégradation est régulée par l'ubiquitination et la SUMOylation⁶⁵. De plus, DRP1 et MFN1/2 étant des GTPases, leur activité peut être influencée par le taux de production de GTP dans les mitochondries⁶⁶. Par conséquent, bien que l'expression de ces protéines reste constante, cela ne reflète pas nécessairement une activité ou une localisation protéique inchangée^67,68. En effet, les répertoires de protéines ayant subi des modifications post-traductionnelles (PTM) constituent souvent la première ligne de défense, assurant la médiation des réponses au stress aigu. En présence d'un stress métabolique modéré dans notre modèle, il est probable que les PTM favorisent une activité accrue des protéines de fusion et de fission afin de restaurer l'intégrité mitochondriale sans nécessiter d'activation supplémentaire de ces gènes au niveau de l'ARNm ou des protéines.
L'ensemble des données présentées met en évidence la régulation complexe et temporelle de la morphologie mitochondriale et les difficultés liées à l'élucidation de ces mécanismes. Pour étudier l'expression génique, il est indispensable d'identifier au préalable les gènes cibles spécifiques de la voie de signalisation. Or, nos données montrent que les gènes d'une même voie ne répondent pas de la même manière à un même stress. En effet, des études antérieures ont démontré que différents gènes d'une même voie peuvent présenter des profils de réponse temporelle distincts^30,46. Par ailleurs, des mécanismes post-transcriptionnels complexes perturbent la relation entre la transcription et la fonction des gènes. Les études protéomiques peuvent éclairer l'impact des modifications post-traductionnelles sur la fonction protéique, mais elles présentent également des limites, notamment un faible débit, un rapport signal/bruit élevé et une faible résolution.
Dans ce contexte, l'étude de la morphologie mitochondriale par MET et MEL présente un fort potentiel pour répondre à des questions fondamentales sur la relation entre la dynamique et la fonction mitochondriales et leur influence sur les maladies. Plus important encore, la MET offre une méthode directe de mesure de la morphologie mitochondriale, un indicateur convergent du dysfonctionnement et de la dynamique mitochondriaux⁵¹. La MEL offre également une méthode directe de visualisation des événements de fission et de fusion dans un environnement cellulaire tridimensionnel, permettant la quantification du remodelage mitochondrial dynamique même en l'absence de modifications de l'expression génique³³. Nous soulignons ici l'utilité des techniques d'imagerie mitochondriale dans les maladies mitochondriales secondaires. Ces maladies sont généralement caractérisées par un stress métabolique chronique léger, marqué par un remodelage subtil des réseaux mitochondriaux plutôt que par des lésions mitochondriales aiguës. Cependant, la compensation mitochondriale nécessaire au maintien de la mitose en situation de stress chronique a des conséquences fonctionnelles importantes. Dans le domaine des neurosciences, une meilleure compréhension de ces mécanismes compensatoires pourrait fournir des informations importantes sur la neuropathologie pléiotrope associée au dysfonctionnement mitochondrial.
En définitive, nos données soulignent l'utilité des techniques d'imagerie pour comprendre les conséquences fonctionnelles des interactions complexes entre l'expression génique, les modifications protéiques et l'activité protéique qui contrôlent la dynamique mitochondriale neuronale. Nous avons utilisé le PPA pour modéliser le dysfonctionnement mitochondrial dans un modèle de cellules neuronales afin de mieux comprendre la composante mitochondriale des TSA. Les cellules SH-SY5Y traitées au PPA ont présenté des modifications de la morphologie mitochondriale : les mitochondries sont devenues petites et rondes, et leurs crêtes étaient mal définies, comme observé par MET. L'analyse MEL montre que ces modifications surviennent concomitamment à une augmentation des événements de fission et de fusion pour maintenir le réseau mitochondrial en réponse à un stress métabolique modéré. De plus, le PPA perturbe significativement la régulation transcriptionnelle du métabolisme et de l'homéostasie mitochondriaux. Nous avons identifié cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 et OPA1 comme des régulateurs mitochondriaux clés perturbés par le stress induit par le PPA et susceptibles de jouer un rôle dans la médiation des modifications de la morphologie et de la fonction mitochondriales induites par le PPA. Des études complémentaires sont nécessaires pour mieux caractériser les modifications temporelles induites par le PPA au niveau de l'expression génique, de l'activité protéique, de la localisation et des modifications post-traductionnelles. Nos données soulignent la complexité et l'interdépendance des mécanismes de régulation impliqués dans la réponse au stress mitochondrial et démontrent l'utilité de la microscopie électronique à transmission (MET) et d'autres techniques d'imagerie pour des études mécanistiques plus ciblées.
La lignée cellulaire SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) a été achetée chez Sigma-Aldrich. Les cellules SH-SY5Y ont été cultivées dans un milieu de Dulbecco modifié/F-12 (DMEM/F-12) additionné de L-glutamine (SC09411, ScienCell) dans des flacons de 25 cm² supplémentés avec 20 % de sérum de veau fœtal (SVF) (10493106, ThermoFisher Scientific) et 1 % de pénicilline-streptomycine (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) à 37 °C et 5 % de CO₂. Les cellules ont été sous-cultivées jusqu'à confluence à 80 % à l'aide de trypsine-EDTA à 0,05 % (15400054, ThermoFisher Scientific), centrifugées à 300 g et ensemencées à une densité d'environ 7 × 10⁵ cellules/ml. Toutes les expériences ont été réalisées sur des cellules SH-SY5Y non différenciées entre les passages 19 et 22. Le PPA est administré sous forme de NaP. Dissoudre la poudre de NaP (CAS n° 137-40-6, formule chimique C₃H₅NaO₂, P5436-100G, Sigma-Aldrich) dans de l'eau MilliQ tiède à une concentration de 1 M et conserver à 4 °C. Le jour du traitement, diluer cette solution avec du PPA 1 M pour obtenir des concentrations de PPA de 3 mM et 5 mM dans un milieu sans sérum (DMEM/F-12 avec L-glutamine). Les concentrations de traitement utilisées dans toutes les expériences étaient les suivantes : absence de PPA (0 mM, témoin), 3 mM et 5 mM de PPA. Les expériences ont été réalisées avec au moins trois réplicats biologiques.
Des cellules SH-SY5Y ont été ensemencées dans des flacons de 25 cm³ à une concentration de 5,5 × 10⁵ cellules/ml et cultivées pendant 24 heures. Le traitement au PPA a été ajouté aux flacons 24 heures avant l'incubation. Les culots cellulaires ont été recueillis selon les protocoles de sous-culture classiques pour tissus de mammifères (décrits précédemment). Le culot cellulaire a été remis en suspension dans 100 µl de glutaraldéhyde à 2,5 % dans du PBS 1× et conservé à 4 °C jusqu'au traitement. Les cellules SH-SY5Y ont été brièvement centrifugées pour former un culot et éliminer la solution de glutaraldéhyde à 2,5 % dans du PBS 1×. Le culot a été remis en suspension dans un gel d'agarose à 4 % préparé dans de l'eau distillée (le rapport volume d'agarose/volume de culot est de 1:1). Des morceaux d'agarose ont été déposés sur des grilles placées sur des plaques planes et recouverts de 1-hexadécène avant congélation à haute pression. Les échantillons ont été congelés dans de l'acétone anhydre à 100 % à -90 °C pendant 24 heures. La température a ensuite été portée à -80 °C et une solution de tétroxyde d'osmium à 1 % et de glutaraldéhyde à 0,1 % a été ajoutée. Les échantillons ont été conservés à -80 °C pendant 24 heures. Après cela, la température a été progressivement augmentée jusqu'à la température ambiante sur plusieurs jours : de -80 °C à -50 °C pendant 24 heures, puis à -30 °C pendant 24 heures, à -10 °C pendant 24 heures et enfin à température ambiante.
Après préparation cryogénique, les échantillons ont été imprégnés de résine et des coupes ultrafines (∼100 nm) ont été réalisées à l'aide d'un ultramicrotome Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). Les coupes ont été colorées à l'acétate d'uranyle à 2 % et au citrate de plomb. Les échantillons ont été observés au microscope électronique à transmission FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (anciennement FEI), Eindhoven, Pays-Bas) fonctionnant à 200 kV (émetteur Lab6) et équipé d'une caméra CCD Gatan (Gatan, Royaume-Uni) munie d'un filtre énergétique Tridiem.
Pour chaque réplicat technique, au moins 24 images de cellules uniques ont été acquises, soit un total de 266 images. Toutes les images ont été analysées à l'aide des macros « Région d'intérêt » (ROI) et « Mitochondries ». Cette dernière, basée sur des méthodes publiées^17,31,32, permet un traitement par lots semi-automatisé des images TEM dans Fiji/ImageJ⁶⁹. En résumé : l'image est inversée par soustraction du fond à l'aide d'un algorithme de soustraction par effet de boule (rayon de 60 pixels), d'un filtre passe-bande FFT (avec des limites supérieure et inférieure de 60 et 8 pixels respectivement) et d'une suppression des lignes verticales avec une tolérance d'orientation de 5 %. L'image traitée est ensuite seuillée automatiquement à l'aide d'un algorithme d'entropie maximale, ce qui génère un masque binaire. Les régions d'image associées aux ROI sélectionnées manuellement dans les images TEM brutes ont été extraites, caractérisant les mitochondries et excluant la membrane plasmique et les autres régions à fort contraste. Pour chaque ROI extraite, les particules binaires de plus de 600 pixels ont été analysées. Leur surface, leur périmètre, leurs axes majeur et mineur, leur diamètre de Feret, leur rondeur et leur circularité ont été mesurés à l'aide des fonctions de mesure intégrées de Fiji/ImageJ. Conformément à Merrill, Flippo et Strack (2017), l'aire², le rapport d'aspect (rapport des axes majeur et mineur) et le facteur de forme (FF) ont été calculés à partir de ces données, où FF = périmètre²/4π × aire. La définition de la formule paramétrique est disponible dans Merrill, Flippo et Strack (2017). Les macros mentionnées sont disponibles sur GitHub (voir la déclaration de disponibilité des données). En moyenne, environ 5 600 particules ont été analysées par traitement PPA, pour un total d'environ 17 000 particules (données non présentées).
Les cellules SH-SH5Y ont été placées dans des boîtes de culture à 8 puits (ThermoFisher, réf. 155411) pour permettre leur adhésion pendant une nuit, puis incubées avec du TMRE dilué au 1/1000 (ThermoFisher, réf. T669) et du Hoechst 33342 dilué au 1/200 (Sigma-Aldrich, réf. H6024). Les images ont été acquises à l'aide de lasers de 405 nm et 561 nm pendant 10 minutes. Les images brutes ont été acquises sous forme de piles Z contenant 10 micrographies, avec un pas z de 0,2 µm entre les images, à 12 temps d'acquisition successifs. Les images ont été collectées à l'aide d'un microscope à super-résolution Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Allemagne) équipé d'un objectif LCI Plan Apochromate 100x/1,4 Oil DIC M27. Les images ont été analysées dans ImageJ en utilisant un pipeline précédemment décrit et le plugin ImageJ pour mesurer les événements de fusion et de fission, le nombre moyen de structures mitochondriales et le volume mitochondrial moyen par cellule33. Les macros MEL sont disponibles sur GitHub (voir la déclaration de disponibilité des données).
Les cellules SH-SY5Y ont été cultivées dans des plaques à six puits à une densité de 0,3 × 10⁶ cellules/mL pendant 24 heures avant traitement. L'ARN a été extrait selon le protocole Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) légèrement modifié : 300 µL de tampon de lyse d'ARN ont été ajoutés dans chaque puits avant élimination, et chaque échantillon a été lysé en dernière étape avec 30 µL d'eau exempte de DNase/RNase. La quantité et la qualité de tous les échantillons ont été vérifiées à l'aide d'un spectrophotomètre UV-Vis NanoDrop ND-1000. Les protéines totales des lysats cellulaires ont été extraites à l'aide de 200 µL de tampon de lyse RIPA, et leur concentration a été quantifiée par le test de Bradford.
La synthèse d'ADNc a été réalisée à l'aide du kit de synthèse d'ADNc Tetro™ (BIO-65043, Meridian Bioscience) selon les instructions du fabricant, avec quelques modifications. L'ADNc a été synthétisé dans un volume réactionnel de 20 μl à partir de 0,7 à 1 μg d'ARN total. Les amorces ont été sélectionnées à partir de publications antérieures (références 42 à 78, tableau S1) et les sondes correspondantes ont été conçues à l'aide du logiciel PrimerQuest (Integrated DNA Technologies). L'expression de tous les gènes d'intérêt a été normalisée par rapport au gène nucléaire B2M. L'expression des gènes STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC et OPA1 a été mesurée par RT-qPCR. Le mélange maître comprenait la polymérase LUNA Taq (M3003L, New England Biolabs), des amorces sens et antisens à 10 μM, de l'ADNc et de l'eau de qualité PCR, pour un volume final de 10 μL par réaction. L'expression des gènes de division et de fission (DRP1, MFN1/2) a été mesurée par des tests multiplex TaqMan. Le mélange maître Luna Universal Probe qPCR (M3004S, New England Biolabs) a été utilisé conformément aux instructions du fabricant, avec quelques modifications mineures. Ce mélange maître pour RT-qPCR multiplex comprend 1X de polymérase LUNA Taq, des amorces sens et antisens à 10 μM, une sonde à 10 μM, de l'ADNc et de l'eau de qualité PCR, pour un volume final de 20 μL par réaction. La RT-qPCR a été réalisée à l'aide d'un Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG – numéro de série : R0618110). Les conditions de cyclage sont présentées dans le tableau S1. Tous les échantillons d'ADNc ont été amplifiés en triplicata et une courbe standard a été établie à l'aide d'une série de dilutions décimales. Les valeurs aberrantes parmi les échantillons en triplicata présentant un écart-type du seuil de cycle (Ct) > 0,5 ont été exclues de l'analyse afin de garantir la reproductibilité des données^30,72. L'expression génique relative a été calculée par la méthode 2^-ΔΔCt79.
Des échantillons de protéines (60 μg) ont été mélangés à un tampon de chargement de Laemmli dans un rapport 2:1 et déposés sur un gel de protéines incolore à 12 % (Bio-Rad n° 1610184). Les protéines ont été transférées sur une membrane de PVDF (fluorure de polyvinylidène) (n° 170-84156, Bio-Rad) à l'aide du système Trans-Blot Turbo (n° 170-4155, Bio-Rad). Après blocage, la membrane a été incubée avec les anticorps primaires appropriés (OPA1, MFN1, MFN2 et DRP1) (dilution 1:1000) pendant 48 heures, puis avec les anticorps secondaires (dilution 1:10 000) pendant 1 heure. Les membranes ont ensuite été imagées à l'aide du substrat Clarity Western ECL (n° 170-5061, Bio-Rad) et enregistrées avec un système Bio-Rad ChemiDoc MP. Le logiciel ImageLab version 6.1 a été utilisé pour l'analyse des western blots. Le gel et le transfert originaux sont présentés dans la figure S1. Les informations relatives aux anticorps sont fournies dans le tableau S2.
Les données sont présentées sous forme de moyenne et d'erreur standard à la moyenne (SEM) d'au moins trois échantillons indépendants. La normalité des données a été vérifiée par le test de Shapiro-Wilk (sauf indication contraire) avant de supposer une distribution gaussienne et des écarts-types égaux, puis de procéder aux analyses. L'analyse statistique a également été réalisée à l'aide du test LSD de Fisher (p < 0,05), d'une ANOVA à un facteur (moyenne du groupe traité vs. moyenne du groupe témoin) et du test de comparaisons multiples de Dunnett (p < 0,05). Les valeurs de p significatives sont indiquées sur le graphique par *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 et ****p < 0,0001. Toutes les analyses statistiques et les graphiques ont été réalisés et générés avec GraphPad Prism 9.4.0.
Les macros Fiji/ImageJ pour l'analyse d'images TEM sont disponibles publiquement sur GitHub : https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. La macro Mitochondrial Event Locator (MEL) est disponible publiquement sur GitHub : https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
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