Adresse actuelle : Cologne 50931, Allemagne, Pôle d’excellence de Cologne pour la recherche sur la réponse au stress cellulaire dans les maladies liées au vieillissement (CECAD).
La neurodégénérescence associée aux maladies mitochondriales est considérée comme irréversible en raison de la plasticité métabolique limitée des neurones. Cependant, l'impact d'un dysfonctionnement mitochondrial sur l'autonomie métabolique neuronale reste mal compris. Dans cette étude, nous présentons le protéome spécifique des neurones de Purkinje présentant un déficit progressif de la phosphorylation oxydative (OXPHOS) induit par une perturbation de la dynamique de fusion mitochondriale. Nos résultats montrent que le dysfonctionnement mitochondrial déclenche une modification profonde du profil protéomique, conduisant à l'activation séquentielle de programmes métaboliques précis avant la mort cellulaire. De façon inattendue, nous avons observé une forte induction de la pyruvate carboxylase (PCx) et d'autres enzymes anti-âge impliquées dans le métabolisme des intermédiaires du cycle de Krebs. L'inhibition de la PCx exacerbe le stress oxydatif et la neurodégénérescence, suggérant un effet protecteur de l'athérosclérose sur les neurones déficients en OXPHOS. La restauration de la fusion mitochondriale dans les neurones en dégénérescence terminale inverse complètement ces caractéristiques métaboliques, prévenant ainsi la mort cellulaire. Nos résultats identifient des voies jusqu'alors inconnues qui confèrent une résilience au dysfonctionnement mitochondrial et montrent que la neurodégénérescence peut être inversée même aux stades avancés de la maladie.
Le rôle central des mitochondries dans le maintien du métabolisme énergétique neuronal est mis en évidence par l'étendue des symptômes neurologiques associés aux maladies mitochondriales humaines. La plupart de ces maladies sont causées par des mutations génétiques régulant l'expression des gènes mitochondriaux (1, 2) ou par la destruction de gènes liés à la dynamique mitochondriale, affectant indirectement la stabilité de l'ADN mitochondrial (ADNmt) (3, 4). Des études sur des modèles animaux ont montré qu'en réponse à un dysfonctionnement mitochondrial dans les tissus environnants, des voies métaboliques conservées (5-7) peuvent être activées, ce qui apporte des informations importantes pour une compréhension approfondie de la pathogenèse de ces maladies complexes. À l'inverse, notre compréhension des modifications métaboliques de types cellulaires spécifiques, induites par l'insuffisance générale de la production d'adénosine triphosphate (ATP) mitochondriale cérébrale, est fondamentale (8), soulignant la nécessité d'identifier des cibles thérapeutiques permettant de prévenir la maladie ou la neurodégénérescence (9). Le manque d'informations tient au fait que les cellules nerveuses sont généralement considérées comme ayant une flexibilité métabolique très limitée comparée aux types cellulaires des tissus environnants (10). Étant donné que ces cellules jouent un rôle central dans la coordination de l'apport de métabolites aux neurones afin de favoriser la transmission synaptique et de répondre aux lésions et aux pathologies, la capacité d'adapter le métabolisme cellulaire aux conditions difficiles du tissu cérébral est presque exclusivement réservée aux cellules gliales (11-14). De plus, l'hétérogénéité cellulaire inhérente au tissu cérébral entrave considérablement l'étude des modifications métaboliques qui surviennent dans des sous-groupes neuronaux spécifiques. Par conséquent, on connaît peu de choses sur les conséquences cellulaires et métaboliques exactes d'un dysfonctionnement mitochondrial dans les neurones.
Afin de comprendre les conséquences métaboliques d'un dysfonctionnement mitochondrial, nous avons isolé des neurones de Purkinje (NP) à différents stades de neurodégénérescence induite par la destruction de la protéine de fusion de la membrane externe mitochondriale (Mfn2). Bien que les mutations de Mfn2 chez l'humain soient associées à une forme de neuropathie motrice et sensorielle héréditaire connue sous le nom de maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 2A (15), la destruction conditionnelle de Mfn2 chez la souris constitue un modèle reconnu d'induction d'un dysfonctionnement de la phosphorylation oxydative (OXPHOS). Les différents sous-types neuronaux (16-19) et le phénotype neurodégénératif qui en résulte s'accompagnent de symptômes neurologiques progressifs, tels que des troubles du mouvement (18, 19) ou une ataxie cérébelleuse (16). En combinant la protéomique quantitative sans marquage (LFQ), la métabolomique, l'imagerie et des méthodes virologiques, nous démontrons que la neurodégénérescence progressive induit fortement l'expression de la pyruvate carboxylase (PCx) et d'autres facteurs impliqués dans l'artériosclérose des neurones périneuronaux (PN) in vivo. Pour vérifier la pertinence de cette observation, nous avons spécifiquement inhibé l'expression de PCx dans des PN déficients en Mfn2 et constaté que cette inhibition aggravait le stress oxydatif et accélérait la neurodégénérescence, prouvant ainsi que l'azoospermie confère une adaptabilité métabolique à la mort cellulaire. La surexpression de MFN2 permet de restaurer complètement la viabilité des PN en dégénérescence terminale, caractérisée par un déficit sévère en OXPHOS, une consommation massive d'ADN mitochondrial et un réseau mitochondrial apparemment altéré. Ceci souligne que cette forme de neurodégénérescence peut même présenter une réversibilité à un stade avancé de la maladie, avant la mort cellulaire.
Afin de visualiser les mitochondries dans les neurones pyramidaux (PN) Mfn2 KO, nous avons utilisé une lignée de souris permettant aux mitochondries dépendantes de la Cre de cibler l'expression de la protéine fluorescente jaune (YFP) (mtYFP) (20) et avons examiné la morphologie mitochondriale in vivo. Nous avons constaté que l'inactivation du gène Mfn2 dans les PN entraînait une division progressive du réseau mitochondrial (Figure S1A), les premiers changements étant observés à l'âge de 3 semaines. En revanche, la dégénérescence importante de la couche cellulaire des PN, mise en évidence par la perte d'immunomarquage de la calbindine, ne débutait qu'à l'âge de 12 semaines (Figure 1, A et B). Ce décalage temporel entre les premiers changements de morphologie mitochondriale et l'apparition visible de la mort neuronale nous a incités à étudier les modifications métaboliques déclenchées par le dysfonctionnement mitochondrial avant la mort cellulaire. Nous avons mis au point une stratégie de tri cellulaire par fluorescence (FACS) pour isoler les neurones pyramidaux (PN) exprimant la YFP (YFP+) (Figure 1C), et chez des souris témoins (Mfn2+/loxP::mtYFP loxP-stop-loxP::L7-cre), désignées ci-après par CTRL (Figure S1B). L'optimisation de la stratégie de sélection, basée sur l'intensité relative du signal YFP, nous permet de purifier les neurones pyramidaux YFP+ (YFP_élevé) des neurones non pyramidaux (YFP_négatif) (Figure S1B) ou des fragments axonaux/dendritiques fluorescents putatifs (YFP_faible ; Figure S1D, gauche), ce qui est confirmé par microscopie confocale (Figure S1D, droite). Afin de vérifier l'identité de la population ainsi identifiée, nous avons réalisé une analyse protéomique par LFQ, puis une analyse en composantes principales, et avons constaté une nette séparation entre les cellules YFP_élevé et YFP_négatif (Figure S1C). Les cellules YFP^high ont montré un enrichissement net en marqueurs connus de neurones pyramidaux (PN) (Calb1, Pcp2, Grid2 et Itpr3) (21, 22), mais aucun enrichissement en protéines couramment exprimées dans les neurones ou d'autres types cellulaires (Figure 1D). La comparaison d'échantillons de cellules YFP^high classées, collectés lors d'expériences indépendantes, a révélé un coefficient de corrélation supérieur à 0,9, démontrant une bonne reproductibilité entre les réplicats biologiques (Figure S1E). En résumé, ces données ont validé notre stratégie d'isolement rapide et spécifique de PN viables. Le système d'expression de L7-cre utilisé induisant une recombinaison mosaïque dès la première semaine suivant la naissance (23), nous avons procédé à la sélection de souris parmi les souris témoins (CTRL) et les souris conditionnelles (Mfn2^{loxP/loxP::mtYFP loxP-stop-loxP::L7-cre) afin de collecter les neurones. Une fois la recombinaison achevée, les souris sont appelées Mfn2cKO à l'âge de 4 semaines. Comme point final, nous avons choisi l'âge de 8 semaines, lorsque la couche PN était intacte malgré une fragmentation mitochondriale évidente (figures 1B et S1A). Au total, nous avons quantifié 3 013 protéines, dont environ 22 % étaient annotées à partir du protéome mitochondrial (figure 1E) grâce à MitoCarta 2.0 (24). L'analyse d'expression différentielle des gènes réalisée à la 8e semaine a montré que seulement 10,5 % des protéines présentaient des variations significatives (figures 1F et S1F), dont 195 étaient sous-exprimées et 120 surexprimées (figure 1F). Il est à noter que l'analyse des voies métaboliques innovantes de cet ensemble de données révèle que les gènes différentiellement exprimés appartiennent principalement à un ensemble restreint de voies métaboliques spécifiques (figure 1G). Il est intéressant de noter que, bien que la régulation négative des voies liées à la phosphorylation oxydative et à la signalisation calcique confirme l'induction d'un dysfonctionnement mitochondrial dans les PN déficients en fusion, d'autres catégories impliquant principalement le métabolisme des acides aminés sont significativement régulées à la hausse, ce qui est cohérent avec le métabolisme observé dans les PN présentant un dysfonctionnement mitochondrial.
(A) Photographies confocales représentatives de coupes de cervelet de souris CTRL et Mfn2cKO montrant une perte progressive de neurones de Purkinje (calbindine, gris) ; les noyaux ont été contre-colorés au DAPI. (B) Quantification de (A) (analyse de variance à un facteur, ***P < 0,001 ; n = 4 à 6 cercles provenant de trois souris). (C) Protocole expérimental. (D) Carte thermique de distribution des marqueurs spécifiques aux cellules de Purkinje (en haut) et aux autres types cellulaires (au milieu). (E) Diagramme de Venn montrant le nombre de protéines mitochondriales identifiées dans les neurones de Purkinje classés. (F) Diagramme en volcan des protéines différentiellement exprimées dans les neurones Mfn2cKO à 8 semaines (seuil de signification : 1,3). (G) L’analyse des voies de la créativité montre les cinq voies de régulation positive (rouge) et négative (bleu) les plus importantes dans les neurones de Purkinje Mfn2cKO classés à 8 semaines. Le niveau d’expression moyen de chaque protéine détectée est indiqué. Carte thermique en niveaux de gris : valeur P ajustée. ns, non significatif.
Les données protéomiques ont montré que l'expression protéique des complexes I, III et IV diminuait progressivement. Ces complexes contenaient tous des sous-unités essentielles codées par l'ADNmt, tandis que le complexe II, codé uniquement par l'ADN nucléaire, restait globalement inchangé (figures 2A et S2A). Conformément aux résultats protéomiques, l'immunohistochimie de coupes de tissu cérébelleux a révélé que le niveau de la sous-unité MTCO1 (sous-unité 1 de la cytochrome C oxydase mitochondriale) du complexe IV dans le PN diminuait progressivement (figure 2B). La sous-unité Mtatp8, codée par l'ADNmt, était significativement réduite (figure S2A), tandis que le niveau à l'état d'équilibre de la sous-unité de l'ATP synthase codée par l'ADN nucléaire demeurait inchangé, ce qui est cohérent avec la formation stable du sous-ensemble F1 de l'ATP synthase lorsque l'expression de l'ADNmt est stable. L'évaluation du niveau d'ADNmt dans les PN Mfn2cKO triées par PCR quantitative en temps réel (qPCR) a confirmé la diminution progressive du nombre de copies d'ADNmt. Comparé au groupe témoin, à 8 semaines, seulement 20 % environ du niveau d'ADNmt était conservé (Figure 2C). Conformément à ces résultats, la coloration par microscopie confocale des PN Mfn2cKO a permis de détecter l'ADN et de mettre en évidence la consommation de nucléotides mitochondriaux au cours du temps (Figure 2D). Nous avons constaté que seuls certains candidats impliqués dans la dégradation des protéines mitochondriales et la réponse au stress étaient surexprimés, notamment Lonp1, Afg3l2 et Clpx, ainsi que les facteurs d'assemblage du complexe OXPHOS. Aucune modification significative des niveaux de protéines impliquées dans l'apoptose n'a été détectée (Figure S2B). De même, nous avons observé que les canaux mitochondriaux et du réticulum endoplasmique impliqués dans le transport du calcium ne présentaient que des modifications mineures (Figure S2C). De plus, l'évaluation des protéines liées à l'autophagie n'a révélé aucun changement significatif, ce qui concorde avec l'induction visible d'autophagosomes observée in vivo par immunohistochimie et microscopie électronique (Figure S3). Cependant, le dysfonctionnement progressif de la phosphorylation oxydative (OXPHOS) dans les neurones de projection (PN) s'accompagne de modifications ultrastructurales mitochondriales évidentes. Des amas mitochondriaux sont visibles dans les corps cellulaires et les arbres dendritiques des PN Mfn2cKO âgés de 5 et 8 semaines, et la structure de la membrane interne a subi des altérations profondes (Figure S4, A et B). En accord avec ces modifications ultrastructurales et une diminution significative de l'ADNmt, l'analyse de tranches de cervelet aiguës par marquage au tétraméthylrhodamine méthyl ester (TMRM) a montré que le potentiel de membrane mitochondrial des PN Mfn2cKO était significativement diminué (Figure S4C).
(A) Analyse cinétique de l'expression du complexe OXPHOS. Seules les protéines avec P < 0,05 à 8 semaines (ANOVA à deux facteurs) sont prises en compte. Ligne pointillée : absence de correction par rapport au groupe contrôle (CTRL). (B) À gauche : exemple de coupe de cervelet marquée avec un anticorps anti-MTCO1 (échelle : 20 µm). La zone occupée par les corps cellulaires des cellules de Purkinje est colorée en jaune. À droite : quantification des niveaux de MTCO1 (ANOVA à un facteur ; n = 7 à 20 cellules analysées provenant de trois souris). (C) Analyse qPCR du nombre de copies d'ADNmt dans les cellules PN triées (ANOVA à un facteur ; n = 3 à 7 souris). (D) À gauche : exemple de coupe de cervelet marquée avec un anticorps anti-ADN (échelle : 20 µm). La zone occupée par les corps cellulaires des cellules de Purkinje est colorée en jaune. À droite : quantification des lésions de l'ADNmt (ANOVA à un facteur ; n = 5 à 9 cellules provenant de trois souris). (E) Exemple de coupe aiguë de cervelet montrant des cellules de Purkinje mitoYFP+ ​​(flèche) lors d'un enregistrement patch-clamp en configuration cellule entière. (F) Quantification de la courbe I-V. (G) Enregistrements représentatifs d'une injection de courant dépolarisant dans des cellules de Purkinje CTRL et Mfn2cKO. Tracé supérieur : première impulsion déclenchant un potentiel d'action (PA). Tracé inférieur : fréquence maximale des PA. (H) Quantification des entrées postsynaptiques spontanées (sPSP). Le tracé d'enregistrement représentatif et son zoom sont présentés en (I). Une analyse de variance à un facteur a été réalisée sur n = 5 à 20 cellules provenant de trois souris. Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± erreur standard à la moyenne (SEM) ; *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001. (J) Tracés représentatifs de PA spontanés enregistrés en mode patch-clamp perforé. Tracé supérieur : fréquence maximale des PA. Tracé inférieur : zoom sur un PA unique. (K) Quantification des fréquences moyenne et maximale des PA selon (J). Test de Mann-Whitney ; n = 5 cellules ont été analysées chez quatre souris. Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM) ; sans importance.
Des dommages manifestes à la phosphorylation oxydative (OXPHOS) ont été détectés chez les neurones PN Mfn2cKO âgés de 8 semaines, indiquant une altération sévère de leur fonction physiologique. Par conséquent, nous avons analysé les caractéristiques électriques passives de ces neurones déficients en OXPHOS à 4-5 semaines et à 7-8 semaines par enregistrements patch-clamp en configuration cellule entière sur des tranches de cervelet aiguës (Figure 2E). De façon inattendue, le potentiel de membrane au repos et la résistance d'entrée moyens des neurones Mfn2cKO étaient similaires à ceux des neurones témoins, malgré de subtiles différences intercellulaires (Tableau 1). De même, à 4-5 semaines, aucune modification significative de la relation courant-tension (courbe IV) n'a été observée (Figure 2F). Cependant, aucun neurone Mfn2cKO âgé de 7-8 semaines n'a survécu au protocole IV (étape d'hyperpolarisation), ce qui indique une sensibilité marquée au potentiel d'hyperpolarisation à ce stade tardif. En revanche, dans les neurones Mfn2cKO, les courants dépolarisants à l'origine des décharges répétitives de potentiels d'action (PA) sont bien tolérés, ce qui indique que leurs profils de décharge globaux ne diffèrent pas significativement de ceux des neurones témoins âgés de 8 semaines (Tableau 1 et Figure 2G). De même, la fréquence et l'amplitude des courants postsynaptiques spontanés (sPSC) étaient comparables à celles du groupe témoin, et la fréquence des événements augmentait de façon similaire de 4 à 5 semaines, puis à 7 et enfin à 8 semaines (Figure 2, H et I). La période de maturation synaptique des neurones pyramidaux (PN) est de 25 semaines. Des résultats similaires ont été obtenus après enregistrement de patchs perforés de PN. Cette configuration empêche la compensation potentielle des déficits d'ATP cellulaire, comme cela pourrait se produire lors d'un enregistrement patch-clamp en configuration cellule entière. En particulier, le potentiel de membrane au repos et la fréquence de décharge spontanée des neurones Mfn2cKO n'étaient pas affectés (Figure 2, J et K). En résumé, ces résultats indiquent que les neurones pyramidaux présentant un dysfonctionnement évident de la phosphorylation oxydative peuvent bien gérer les schémas de décharge à haute fréquence, ce qui indique l'existence d'un mécanisme de compensation leur permettant de maintenir des réponses électrophysiologiques quasi normales.
Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± erreur standard à la moyenne (analyse de variance à un facteur, test de comparaisons multiples de Holm-Sidak ; *P < 0,05). L’unité est indiquée entre parenthèses.
Nous avons entrepris d'étudier si une catégorie quelconque de l'ensemble de données protéomiques (Figure 1G) comprenait des voies capables de compenser un déficit sévère en OXPHOS, expliquant ainsi pourquoi les neurones périphériques affectés peuvent conserver une électrophysiologie quasi normale (Figure 2, E à K). L'analyse protéomique a révélé que les enzymes impliquées dans le catabolisme des acides aminés à chaîne ramifiée (BCAA) étaient significativement surexprimées (Figure 3A et Figure S5A), et que le produit final, l'acétyl-CoA (CoA) ou le succinyl-CoA, pouvait compléter les tricarboxylates du cycle de Krebs. Nous avons constaté une augmentation de la concentration des BCAA transaminases 1 (BCAT1) et 2 (BCAT2). Ces enzymes catalysent la première étape du catabolisme des BCAA en générant du glutamate à partir de l'α-cétoglutarate (26). Toutes les sous-unités constituant le complexe déshydrogénase des cétoacides à chaîne ramifiée (BCKD) sont surexprimées (ce complexe catalyse la décarboxylation irréversible du squelette carboné des BCAA résultants) (Figure 3A et Figure S5A). Cependant, aucune modification notable de la concentration des BCAA n'a été observée dans les PN triées, ce qui pourrait être dû à une absorption cellulaire accrue de ces acides aminés essentiels ou à l'utilisation d'autres sources (glucose ou acide lactique) pour compléter le cycle de Krebs (Figure S5B). Les PN dépourvues d'OXPHOS ont également présenté une augmentation des activités de décomposition et de transamination de la glutamine à l'âge de 8 semaines, ce qui se traduit par une surexpression des enzymes mitochondriales glutaminase (GLS) et glutamine pyruvate transaminase 2 (GPT2) (Figure 3, A et C). Il convient de noter que la régulation positive de GLS est limitée à l'isoforme épissée glutaminase C (GLS-GAC) (le changement de Mfn2cKO/CTRL est d'environ 4,5 fois, P = 0,05), et sa régulation positive spécifique dans les tissus cancéreux peut soutenir la bioénergie mitochondriale. (27).
(A) La carte thermique illustre la variation d'expression protéique pour la voie spécifiée à 8 semaines. (B) Exemple de tranche de cervelet marquée avec un anticorps anti-PCx (échelle : 20 µm). La flèche jaune indique le corps cellulaire de la cellule de Purkinje. (C) Analyse de l'expression protéique au cours du temps, identifiée comme un candidat important pour l'athérosclérose (test t multiple, *FDR < 5 % ; n = 3-5 souris). (D) En haut : Schéma illustrant les différentes voies d'entrée du carbone marqué contenu dans le traceur [1-13C]pyruvate (par exemple, via la PDH ou par voie transartérielle). En bas : Le diagramme en violon représente le pourcentage de carbone marqué (M1) converti en acide aspartique, acide citrique et acide malique après marquage de tranches de cervelet aiguës avec du [1-13C]pyruvate (test t apparié ; ** p < 0,01). (E) Analyse complète de l'évolution temporelle de la voie indiquée. Seules les protéines présentant une valeur de P < 0,05 à 8 semaines ont été prises en compte. Ligne pointillée : valeur non ajustée (analyse de variance à deux facteurs ; * P < 0,05 ; *** P < 0,001). Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± erreur standard à la moyenne (SEM).
Dans notre analyse, le catabolisme des acides aminés ramifiés (BCAA) est devenu l'une des principales voies de régulation positive. Ce fait suggère fortement que le volume de ventilation entrant dans le cycle de Krebs pourrait être modifié dans les neurones pyramidaux (PN) dépourvus de phosphorylation oxydative (OXPHOS). Ceci pourrait représenter une forme majeure de remodelage métabolique neuronal, susceptible d'avoir un impact direct sur la physiologie et la survie neuronales lors du maintien d'un dysfonctionnement sévère de l'OXPHOS. Conformément à cette hypothèse, nous avons constaté que la principale enzyme anti-athérosclérotique, la pyruvate carboxyméthylcellulose (PCx), est surexprimée (variation d'environ 1,5 fois chez les souris Mfn2cKO/CTRL ; Figure 3A). Cette enzyme catalyse la conversion du pyruvate en oxaloacétate (28), dont l'expression dans le tissu cérébral est restreinte aux astrocytes (29, 30). Conformément aux résultats protéomiques, la microscopie confocale a montré que l'expression de PCx était spécifiquement et significativement augmentée dans les neurones pyramidaux déficients en OXPHOS, tandis que la réactivité de PCx était principalement restreinte aux cellules gliales de Bergmann adjacentes du groupe contrôle (Figure 3B). Afin de tester fonctionnellement la surexpression de PCx observée, nous avons traité des tranches de cervelet aiguës avec du pyruvate marqué au [1-13C]. Lorsque le pyruvate est oxydé par la pyruvate déshydrogénase (PDH), son marquage isotopique disparaît. Cependant, il est incorporé aux intermédiaires du cycle de Krebs lors de sa métabolisation par les réactions vasculaires (Figure 3D). Confirmant nos données protéomiques, nous avons observé un grand nombre de marqueurs de ce traceur dans l'acide aspartique des tranches Mfn2cKO, tandis que l'acide citrique et l'acide malique présentaient également une tendance modérée, bien que non significative (Figure 3D).
Chez les neurones dopaminergiques de souris MitoPark présentant un dysfonctionnement mitochondrial induit par la destruction spécifique du gène du facteur de transcription mitochondrial A (Tfam) (Figure S6B), l'expression de PCx était également significativement augmentée (31), indiquant que l'artériosclérose induite par l'acide acétonique est régulée lors du dysfonctionnement de la phosphorylation oxydative neuronale (OXPHOS). Il est à noter que des enzymes spécifiques (32-34), potentiellement exprimées dans les neurones et associées à l'artériosclérose, sont significativement surexprimées dans les neurones de projection (PN) déficients en OXPHOS. Parmi ces enzymes figurent la propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), qui convertit le propionyl-CoA en succinyl-CoA, et l'enzyme malique mitochondriale 3 (ME3), dont le rôle principal est de régénérer le pyruvate à partir du malate (Figure 3, A et C) (33, 35). De plus, nous avons observé une augmentation significative de l'enzyme Pdk3, qui phosphoryle et inactive ainsi la PDH (36), tandis qu'aucune modification n'a été détectée au niveau de l'enzyme Pdp1, qui active la PDH, ni au niveau du complexe enzymatique PDH lui-même (Figure 3A). De même, dans les neurones pyramidaux Mern2cKO, la phosphorylation de la sous-unité α1 (PDHE1α) de la pyruvate déshydrogénase, composant E1 du complexe PDH, au niveau de la sérine 293 (connue pour inhiber l'activité enzymatique de la PDH) était accrue (Figure S6C). Le pyruvate n'a pas accès au système vasculaire.
Enfin, nous avons constaté que la voie principale de biosynthèse de la sérine et de la glycine, le cycle mitochondrial du folate (1C) et la biosynthèse de la proline (figures 1G et S5C) sont tous significativement surexprimés, conformément aux données publiées, au cours du processus d'activation. Les tissus environnants sont activés par un dysfonctionnement mitochondrial (5-7). L'analyse confocale, corroborant ces données protéomiques, a montré que dans le modèle de neuropathie périphérique (PN) avec déficit en phosphorylation oxydative (OXPHOS), des tranches de cervelet de souris âgées de 8 semaines étaient soumises à une réponse immunitaire significative induite par la sérine hydroxyméthyltransférase 2 (SHMT2), une enzyme clé du cycle mitochondrial du folate (figure S5D). Dans 13 tranches de cervelet aiguës incubées avec du CU-glucose, des expériences de traçage métabolique ont confirmé la surexpression de la biosynthèse de la sérine et de la proline, indiquant une augmentation du flux d'isoformes carbonées vers la sérine et la proline (figure S5E). Étant donné que les réactions catalysées par GLS et GPT2 sont responsables de la synthèse du glutamate à partir de la glutamine et de la transamination entre le glutamate et l'α-cétoglutarate, leur surexpression indique que les neurones déficients en OXPHOS présentent une demande accrue en glutamate. Ceci pourrait viser à maintenir la biosynthèse accrue de proline (Figure S5C). À l'inverse, une analyse protéomique des astrocytes cérébelleux de souris Mfn2cKO spécifiques de PN a montré que l'expression de ces voies (y compris toutes les antiperoxydases) n'était pas significativement modifiée, démontrant ainsi que cette redirection métabolique est spécifique à la PN dégradée (Fig. S6, D à G).
En résumé, ces analyses ont révélé des profils d'activation temporelle significativement différents pour des voies métaboliques spécifiques dans les neurones pyramidaux. Bien qu'un dysfonctionnement mitochondrial neuronal puisse induire une athérosclérose précoce et un remodelage du cycle de Krebs (figures 3E et S5C), voire des modifications prévisibles de l'expression des complexes I et IV, les altérations de la synthèse de novo de la sérine ne sont apparentes qu'aux stades tardifs. Un dysfonctionnement de la phosphorylation oxydative (OXPHOS) est également observé (figures 3E et S5C). Ces résultats définissent un processus séquentiel dans lequel la réponse mitochondriale (cycle de Krebs) et cytoplasmique (biosynthèse de la sérine) induite par le stress agit en synergie avec l'augmentation de l'athérosclérose dans le cycle de Krebs pour remodeler le métabolisme neuronal.
Les neurones pyramidaux (PN) déficients en OXPHOS âgés de 8 semaines peuvent maintenir une activité d'excitation à haute fréquence et subir une reconnexion métabolique significative pour compenser le dysfonctionnement mitochondrial. Cette découverte ouvre la possibilité intéressante que, même à ce stade, ces cellules puissent bénéficier d'une intervention thérapeutique pour retarder ou prévenir la neurodégénérescence. Nous avons exploré cette possibilité grâce à deux interventions indépendantes. Dans la première méthode, nous avons conçu un vecteur viral adéno-associé (AAV) Cre-dépendant permettant l'expression sélective de MFN2 dans les PN déficients en OXPHOS in vivo (Figure S7A). L'AAV codant pour MFN2 et le gène rapporteur fluorescent mCherry (Mfn2-AAV) a été validé dans des cultures primaires de neurones in vitro, ce qui a permis l'expression de MFN2 de manière Cre-dépendante et la restauration de la morphologie mitochondriale, prévenant ainsi la neuromutation dans les neurones Mfn2cKO (Figure S7, B, D et E). Nous avons ensuite réalisé des expériences in vivo en administrant par voie stéréotaxique le vecteur Mfn2-AAV (âgé de 8 semaines) au cortex cérébelleux de souris Mfn2cKO et de souris témoins, puis analysé des souris âgées de 12 semaines (Figure 4A). Les souris Mfn2cKO traitées sont décédées (Figure 1, A et B) (16). La transduction virale in vivo a induit une expression sélective de neurones pyramidaux (PN) dans certains cercles cérébelleux (Figure S7, G et H). L'injection du vecteur AAV témoin exprimant uniquement la protéine mCherry (Ctrl-AAV) n'a eu aucun effet significatif sur le degré de neurodégénérescence chez les animaux Mfn2cKO. En revanche, l'analyse des souris Mfn2cKO transduites par Mfn2-AAV a révélé un effet protecteur significatif de la couche cellulaire des PN (Figure 4, B et C). En particulier, la densité neuronale semble être presque identique à celle des animaux témoins (Figure 4, B et C, et Figure S7, H et I). L'expression de MFN1, mais pas de MFN2, est tout aussi efficace pour prévenir la mort neuronale (figures 4C et S7, C et F), ce qui indique que l'expression ectopique de MFN1 peut compenser efficacement le déficit en MFN2. Une analyse plus poussée au niveau des neurones de projection individuels a montré que Mfn2-AAV restaurait en grande partie l'ultrastructure mitochondriale, normalisait les niveaux d'ADNmt et inversait la forte expression du marqueur anti-angiogénique PCx (figure 4, C à E). L'examen visuel des souris Mfn2cKO restaurées au repos a révélé une amélioration de leur posture et de leurs symptômes moteurs (mouvements S1 à S3). En conclusion, ces expériences montrent que la réintroduction différée de MFN2 dans les neurones de projection présentant un déficit sévère en phosphorylation oxydative (OXPHOS) suffit à inverser la consommation d'ADNmt et à induire l'athérosclérose, prévenant ainsi la dégénérescence axonale et la mort neuronale in vivo.
(A) Schéma illustrant le protocole expérimental d'injection d'AAV codant pour MFN2 lors de l'activation de la voie métabolique indiquée. (B) Images confocales représentatives de coupes de cervelet de souris Mfn2cKO âgées de 12 semaines, transduites à 8 semaines et marquées avec un anticorps anti-calbindine. À droite : Échelle des fibres axonales. L'échelle du zoom sur les axones est de 450 et 75 µm. (C) À gauche : Quantification de la densité des cellules de Purkinje dans la boucle de transduction AAV (AAV+) (analyse de variance à un facteur ; n = 3 souris). À droite : Analyse des foyers d'ADNmt dans les neurones de Purkinje transduits à la semaine 12 (test t non apparié ; n = 6 cellules provenant de trois souris). * p < 0,05 ; ** p < 0,01. (D) Micrographies électroniques à transmission représentatives des neurones de Purkinje de coupes de cervelet Mfn2cKO transduites avec les vecteurs viraux indiqués. Le masque rose illustre la zone occupée par les dendrites, et le carré jaune en pointillés illustre le zoom disponible à droite ; n représente le noyau. Échelle : 1 µm. (E) montre un exemple de marquage PCx dans des PN transduites à 12 semaines. Échelle : 20 µm. OE : surexpression ; FC : variation d’expression.
Enfin, nous avons étudié l'importance de la survie cellulaire induite par la peroxydase dans les neurones pyramidaux (PN) présentant un dysfonctionnement de la phosphorylation oxydative (OXPHOS). Nous avons généré un vecteur mCherry codant pour un AAV-shRNA (ARN en épingle à cheveux court) ciblant spécifiquement l'ARNm de la PCx murine (AAV-shPCx), et injecté ce virus ou son contrôle non spécifique (AAV-scr) dans le cervelet de souris Mfn2cKO. L'injection a été réalisée à la quatrième semaine (Figure 5A) afin d'obtenir une inhibition efficace de l'expression de la PCx pendant la période où son expression augmente (Figure 3C) et où la couche de neurones pyramidaux est encore intacte (Figure 1A). Il est à noter que l'inhibition de l'expression de la PCx (Figure S8A) entraîne une accélération significative de la mort des neurones pyramidaux, limitée à l'anneau infecté (Figure 5B et 5C). Afin de comprendre le mécanisme des effets métaboliques induits par la surexpression de PCx, nous avons étudié le statut redox des neurones pyramidaux (PN) après l'inhibition de PCx et l'expression simultanée du biocapteur optique Grx1-roGFP2, médié par AAV (Figure S8, B à D), pour évaluer la variation relative du potentiel redox du peptide glutathion (38). Nous avons ensuite réalisé une imagerie de fluorescence à deux photons (FLIM) sur des tranches de cerveau aiguës de souris Mfn2cKO âgées de 7 semaines ou de souris témoins de la même portée afin de détecter d'éventuelles modifications du statut redox cytoplasmique après vérification des conditions FLIM (Figure S8, E à G). L'analyse a révélé une augmentation significative de l'état d'oxydation des PN Mfn2cKO dépourvus de PCx, contrairement aux neurones témoins ou aux PN Mfn2cKO exprimant uniquement un shARN non spécifique (Figure 5, D et E). Lorsque l'expression de PCx a été régulée à la baisse, le pourcentage de PN Mfn2cKO présentant un état fortement oxydé a augmenté de plus de trois fois (Figure 5E), indiquant que la régulation positive de PCx a maintenu la capacité redox des neurones dégénérés.
(A) Schéma illustrant le protocole expérimental d'injection d'AAV codant pour shPCx lors de l'activation de la voie métabolique indiquée. (B) Photographies confocales représentatives de coupes de cervelet de souris Mfn2cKO âgées de 8 semaines, transduites et marquées avec un anticorps anti-calcineurine à 4 semaines. Échelle : 450 µm. (C) Quantification de la densité des cellules de Purkinje dans les boucles transduites par AAV (analyse de variance à un facteur ; n = 3 à 4 souris). Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± erreur standard à la moyenne (SEM) ; ***P < 0,001. (D) Image FLIM représentative montrant la durée de vie moyenne de cellules de Purkinje âgées de 7 semaines exprimant le capteur redox du glutathion Grx1-roGFP2 dans les conditions expérimentales spécifiées. Rapport LUT (table de correspondance) : intervalle de temps de survie (en picosecondes). Échelle : 25 µm. (E) L'histogramme représente la distribution des valeurs de durée de vie de Grx1-roGFP2 issues de (D) (n = 158 à 368 cellules chez deux souris pour chaque condition). Le diagramme circulaire situé au-dessus de chaque histogramme indique le nombre de cellules présentant des valeurs de durée de vie significativement plus longues (rouge, oxydées) ou plus courtes (bleu, réduites), dépassant un écart-type de la durée de vie moyenne observée dans le groupe CTRL-AAV-scr. (F) Le modèle proposé met en évidence l'effet protecteur de la surexpression de PCx neuronal.
En résumé, les données présentées ici montrent que la réexpression de MFN2 peut complètement restaurer la fonction des neurones pancréatiques (NP) à un stade avancé, caractérisés par un déficit sévère en OXPHOS, une déplétion importante de l'ADNmt et une morphologie ista-like extrêmement anormale, permettant ainsi une progression continue même dans les formes avancées de la maladie. La neurodégénérescence témoigne de la réversibilité de l'état précédant la mort cellulaire. Ce degré de flexibilité métabolique est encore accentué par la capacité des neurones à induire l'athérosclérose (une reprogrammation du cycle de Krebs), qui inhibe l'expression de PCx dans les NP dépourvus d'OXPHOS et favorise la mort cellulaire, exerçant ainsi un rôle protecteur (Figure 5F).
Dans cette étude, nous avons démontré que la réponse des neurones de projection (NP) à un dysfonctionnement de la phosphorylation oxydative (OXPHOS) converge progressivement vers l'athérosclérose du cycle de Krebs via une voie d'activation différentielle déclenchée par des programmes métaboliques. Nous avons confirmé l'analyse protéomique par de nombreuses méthodes complémentaires et révélé que, face à un dysfonctionnement mitochondrial sévère, les neurones présentent une forme d'élasticité métabolique jusqu'alors inconnue. À notre grande surprise, ce processus de remodelage ne marque pas nécessairement l'état métabolique terminal qui accompagne la neurodégénérescence de manière progressive et irréversible. Nos données suggèrent plutôt qu'il pourrait constituer un mécanisme de compensation fonctionnelle permettant le maintien des neurones, même au stade précédant la mort cellulaire. Cette découverte indique que les neurones possèdent une plasticité métabolique considérable. Ce fait prouve que la réintroduction ultérieure de MFN2 peut inverser l'expression de marqueurs métaboliques clés et prévenir la dégénérescence des NP. Au contraire, elle inhibe l'athérosclérose et accélère la transition neuronale.
L'une des découvertes les plus fascinantes de nos recherches est que les neurones périphériques (NP) dépourvus de phosphorylation oxydative (OXPHOS) peuvent modifier le métabolisme du cycle de Krebs en régulant positivement des enzymes qui stimulent spécifiquement l'artériosclérose. Le réarrangement métabolique est une caractéristique commune des cellules cancéreuses, dont certaines dépendent de la glutamine pour compléter les intermédiaires du cycle de Krebs et produire des équivalents réducteurs, qui alimentent la chaîne respiratoire et maintiennent la production de précurseurs de la biosynthèse des lipides et des nucléotides (39, 40). Une étude récente a montré que dans les tissus périphériques présentant un dysfonctionnement de l'OXPHOS, la reconnexion du métabolisme de la glutamine/glutamate est également une caractéristique importante (5, 41), où le sens d'entrée de la glutamine dans le cycle de Krebs dépend de la gravité de l'atteinte de l'OXPHOS (41). Cependant, il n'existe pas de preuves claires d'une similarité de la plasticité métabolique neuronale dans l'organisme et de sa pertinence potentielle dans le contexte de la maladie. Une étude in vitro récente a montré que les neurones corticaux primaires mobilisent les réserves de glutamate pour la neurotransmission, favorisant ainsi le métabolisme oxydatif et l'athérosclérose en conditions de stress métabolique (42). Il est à noter que, sous l'effet de l'inhibition pharmacologique de la succinate déshydrogénase, enzyme du cycle de Krebs, la carboxylation du pyruvate permettrait de maintenir la synthèse d'oxaloacétate dans les neurones granulaires cérébelleux en culture (34). Cependant, la pertinence physiologique de ces mécanismes pour le tissu cérébral (où l'athérosclérose serait principalement localisée dans les astrocytes) demeure importante (43). Dans ce contexte, nos données indiquent que les neurones de projection endommagés par la phosphorylation oxydative dans l'organisme peuvent se tourner vers la dégradation des acides aminés ramifiés et la carboxylation du pyruvate, deux sources majeures de reconstitution des intermédiaires du cycle de Krebs. Bien que la contribution potentielle du catabolisme des acides aminés ramifiés (BCAA) au métabolisme énergétique neuronal ait été proposée, en plus du rôle du glutamate et du GABA dans la neurotransmission (44), aucune preuve in vivo de ces mécanismes n'a encore été apportée. Il est donc plausible de supposer que les neurones de projection dysfonctionnels peuvent compenser automatiquement la consommation d'intermédiaires du cycle de Krebs induite par l'assimilation, par une augmentation de l'athérosclérose. En particulier, la surexpression de la PCx pourrait être nécessaire pour maintenir une demande accrue en acide aspartique, comme cela a été suggéré dans les cellules en prolifération présentant un dysfonctionnement mitochondrial (45). Cependant, notre analyse métabolomique n'a révélé aucune modification significative du niveau d'acide aspartique à l'état d'équilibre dans les neurones de projection Mfn2cKO (Figure S6A), ce qui reflète probablement une utilisation métabolique différente de l'acide aspartique entre les cellules en prolifération et les neurones post-mitotiques. Bien que le mécanisme exact de la surexpression de la PCx dans les neurones dysfonctionnels in vivo reste à élucider, nous avons démontré que cette réponse prématurée joue un rôle important dans le maintien de l'état redox des neurones, comme l'ont montré des expériences FLIM sur des tranches de cervelet. En particulier, empêcher les neurones de projection de la PCx peut induire un état d'oxydation accru et accélérer la mort cellulaire. L'activation de la dégradation des acides aminés ramifiés et la carboxylation du pyruvate ne permettent pas de caractériser les tissus périphériques présentant un dysfonctionnement mitochondrial (7). Par conséquent, elles semblent constituer une caractéristique prioritaire des neurones déficients en phosphorylation oxydative (OXPHOS), même si elles ne sont pas la seule, et sont importantes pour la neurodégénérescence.
Les maladies cérébelleuses constituent un type hétérogène de maladies neurodégénératives qui se manifestent généralement par une ataxie et endommagent souvent les neurones pyramidaux (NP) (46). Cette population neuronale est particulièrement vulnérable aux dysfonctionnements mitochondriaux, car leur dégénérescence sélective chez la souris suffit à reproduire de nombreux symptômes moteurs caractéristiques de l'ataxie spinocérébelleuse humaine (16, 47, 48). Selon certaines études, un modèle murin transgénique porteur d'un gène muté est associé à l'ataxie spinocérébelleuse humaine et présente un dysfonctionnement mitochondrial (49, 50), soulignant l'importance d'étudier les conséquences d'un déficit de la phosphorylation oxydative (OXPHOS) dans l'hydrocéphalie à pression négative (HPN). Il est donc particulièrement pertinent d'isoler et d'étudier efficacement cette population neuronale unique. Cependant, étant donné que les NP sont très sensibles à la pression et ne représentent qu'une faible proportion de la population cellulaire cérébelleuse totale, leur séparation sélective en tant que cellules entières demeure un défi pour de nombreuses études omiques. Bien qu'il soit quasiment impossible d'éliminer totalement la contamination par d'autres types cellulaires (notamment les tissus adultes), nous avons combiné une étape de dissociation efficace avec le tri cellulaire par cytométrie de flux (FACS) afin d'obtenir un nombre suffisant de neurones viables pour l'analyse protéomique ultérieure. Nous avons ainsi obtenu une couverture protéique relativement élevée (environ 3 000 protéines) par rapport aux données existantes sur le cervelet entier (51). En préservant la viabilité des cellules entières, la méthode que nous proposons permet non seulement d'étudier les modifications des voies métaboliques mitochondriales, mais aussi celles de leurs homologues cytoplasmiques. Cette méthode complète l'utilisation de marqueurs membranaires mitochondriaux pour enrichir les cellules et quantifier le nombre de mitochondries dans les tissus complexes (52, 53). La méthode que nous décrivons n'est pas uniquement applicable à l'étude des cellules de Purkinje ; elle peut être facilement utilisée pour étudier les modifications métaboliques dans les cerveaux pathologiques, y compris d'autres modèles de dysfonctionnement mitochondrial.
Enfin, nous avons identifié une fenêtre thérapeutique au cours de ce processus de réorganisation métabolique, capable d'inverser complètement les principaux signes de stress cellulaire et de prévenir la dégénérescence neuronale. Par conséquent, la compréhension des implications fonctionnelles de la réorganisation décrite ici pourrait apporter des éclairages fondamentaux sur d'éventuels traitements visant à maintenir la viabilité neuronale lors d'un dysfonctionnement mitochondrial. Des recherches futures, axées sur l'analyse des modifications du métabolisme énergétique dans d'autres types de cellules cérébrales, sont nécessaires pour démontrer pleinement l'applicabilité de ce principe à d'autres maladies neurologiques.
Les souris MitoPark ont ​​été décrites précédemment (31). Les souris C57BL/6N porteuses de séquences loxP flanquant le gène Mfn2 ont été décrites précédemment (18) et croisées avec des souris L7-Cre (23). La descendance doublement hétérozygote obtenue a ensuite été croisée avec des souris homozygotes Mfn2loxP/Mfn2loxP afin de générer des souris invalidées pour le gène Mfn2 spécifiquement dans les cellules de Purkinje (Mfn2loxP/Mfn2loxP ; L7-cre). Dans certains croisements, l’allèle Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) a été introduit par des croisements supplémentaires (20). Toutes les procédures animales ont été réalisées conformément aux directives européennes, nationales et institutionnelles et approuvées par l’Office régional de la nature, de l’environnement et de la protection des animaux de Rhénanie-du-Nord-Westphalie, en Allemagne. Les travaux sur les animaux respectent également les recommandations de la Fédération européenne des associations de sciences des animaux de laboratoire.
Après dislocation cervicale sous anesthésie chez la femme enceinte, l'embryon de souris est isolé (E13). Le cortex est disséqué dans une solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) supplémentée avec 10 mM d'Hepes et étalé sur du milieu de Dulbecco modifié (DMEM) contenant de la papaïne (20 U/ml) et de la cystéine (1 μg/ml). Le tissu est incubé dans du DMEM et dissocié par digestion enzymatique (1 ml) à 37 °C pendant 20 minutes, puis broyé mécaniquement dans du DMEM supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal. Les cellules sont ensemencées sur des lamelles de verre recouvertes de polylysine à une densité de 2 × 10⁶ cellules par boîte de culture de 6 cm ou à une densité de 0,5 × 10⁵ cellules/cm² pour l'analyse d'imagerie. Après 4 heures, le milieu est remplacé par du milieu Neurobasal sans sérum contenant 1 % de supplément B27 et 0,5 mM de GlutaMax. Les neurones ont ensuite été maintenus à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant toute la durée de l'expérience et nourris une fois par semaine. Afin d'induire la recombinaison in vitro, 3 μl (plaque de culture 24 puits) ou 0,5 μl (plaque 24 puits) du vecteur viral AAV9 suivant ont été utilisés pour traiter les neurones le deuxième jour de culture in vitro : AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, référence 105530-AAV9) et AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, référence 105545-AAV9).
Les ADNc de souris Mfn1 et Mfn2 (obtenus respectivement à partir des plasmides Addgene n° 23212 et n° 23213) sont marqués par la séquence V5 (GKPIPNPLLGLDST) en C-terminal et fusionnés à mCherry en phase via la séquence T2A. Grx1-roGFP2 est un don du Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Après remplacement de la cassette tdTomato par des méthodes de clonage classiques, cette cassette a été sous-clonée dans le vecteur pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (référence Addgene : 28306) pour générer les vecteurs pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 et pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Une stratégie similaire a été utilisée pour générer le vecteur de contrôle pAAV-CAG-FLEX-mCherry. La construction AAV-shPCx nécessite un vecteur AAV plasmidique (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) contenant la séquence d'ADN codant pour le shRNA ciblant la PCx murine (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Sous le contrôle du promoteur U6, la protéine mCherry est exprimée sous le contrôle du promoteur CMV. La production des vecteurs AAV auxiliaires a été réalisée conformément aux instructions du fabricant (Cell Biolabs). En résumé, utiliser un plasmide de transfert portant le gène codant pour mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ou Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), ainsi que le gène codant pour la protéine de capside AAV1 et une protéine accessoire. Transfecter transitoirement des cellules 293AAV par la méthode du phosphate de calcium. Le surnageant viral brut a été obtenu par cycles de congélation-décongélation dans un bain de glace carbonique/éthanol et les cellules ont été lysées dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Le vecteur AAV a été purifié par ultracentrifugation en gradient discontinu d'iodixanol (24 heures à 32 000 tr/min et 4 °C) et concentré à l'aide d'un filtre centrifuge Amicon ultra-15. Le titre génomique des vecteurs AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 (2,9 × 10¹³ copies génomiques [GC]/ml), AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 10¹² GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-MFN2-V5 (1,9 × 10¹³ GC/ml) et AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 10¹² GC/ml) a été déterminé comme décrit précédemment (54) par PCR quantitative en temps réel (qPCR).
Les neurones primaires ont été détachés par raclage dans du PBS 1x glacé, centrifugés, puis homogénéisés dans un tampon de lyse PBS contenant 0,5 % de Triton X-100 / 0,5 % de désoxycholate de sodium et un inhibiteur de phosphatase et de protéase (Roche). La quantification des protéines a été réalisée par le test à l'acide bicinchoninique (Thermo Fisher Scientific). Les protéines ont ensuite été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS, puis transférées sur une membrane de polyfluorure de vinylidène (GE Healthcare). Après blocage des sites non spécifiques, la membrane a été incubée avec l'anticorps primaire (voir tableau S1 pour plus de détails) dans du lait à 5 % dans du TBST (solution saline tamponnée au Tris avec Tween), suivie d'étapes de lavage, puis avec l'anticorps secondaire dans du TBST. L'incubation avec l'anticorps primaire a été réalisée pendant une nuit à +4 °C. Après lavage, l'anticorps secondaire a été appliqué pendant 2 heures à température ambiante. Enfin, l'homogénéité du chargement a été vérifiée par incubation de la même membrane avec un anticorps anti-β-actine. Détection par conversion en chimiluminescence et amélioration de la chimiluminescence (GE Healthcare).
Les neurones préalablement ensemencés sur des lamelles de verre ont été fixés avec du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante, au temps indiqué. Les lamelles ont d'abord été perméabilisées avec du Triton X-100 à 0,1 % dans du PBS pendant 5 minutes à température ambiante, puis avec un tampon de blocage [albumine de sérum bovin (BSA) à 3 % dans du PBS]. Le lendemain, les lamelles ont été lavées avec le tampon de blocage et incubées avec l'anticorps secondaire conjugué au fluorophore approprié pendant 2 heures à température ambiante. Enfin, les échantillons ont été lavés abondamment dans du PBS, puis contre-colorés au DAPI (4′,6-diamidino-2-phénylindole) et fixés sur une lame de microscope avec du milieu de montage Aqua-Poly/Mount.
Des souris (mâles et femelles) ont été anesthésiées par injection intrapéritonéale de kétamine (130 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg), et du carprofène (5 mg/kg) leur a été administré par voie sous-cutanée. Elles ont ensuite été placées dans un appareil stéréotaxique (Kopf) muni d'un coussin chauffant. Le crâne a été exposé et, à l'aide d'une fraise dentaire, la partie du cortex cérébelleux correspondant à l'os mésencéphalique (à partir du lambda : queue 1,8, latéral 1, correspondant aux lobules IV et V) a été amincie. Une petite ouverture a ensuite été pratiquée dans le crâne à l'aide d'une aiguille de seringue courbe, en prenant soin de ne pas léser les vaisseaux sanguins sous-jacents. On insère ensuite lentement un fin capillaire de verre étiré dans le micro-orifice (de -1,3 à -1 mm sur la face ventrale de la dure-mère), et 200 à 300 nl d'AAV sont injectés dans le micro-injecteur (Narishige) à l'aide de seringues manuelles (Narishige), à ​​plusieurs reprises et à basse pression, sur une période de 10 à 20 minutes. Après l'infusion, le capillaire est laissé en place pendant 10 minutes supplémentaires afin de permettre la diffusion complète du virus. Une fois les capillaires retirés, la peau est suturée avec soin pour minimiser l'inflammation et favoriser la convalescence de l'animal. Les animaux ont reçu un traitement analgésique (caspofène) pendant plusieurs jours après l'intervention, période durant laquelle leur état physique a été étroitement surveillé. Ils ont ensuite été euthanasiés au moment prévu. Toutes les procédures ont été réalisées conformément aux directives européennes, nationales et institutionnelles et ont été approuvées par l'Office régional de la nature, de l'environnement et de la protection des consommateurs de Rhénanie-du-Nord-Westphalie, en Allemagne.
Les animaux ont été anesthésiés avec de la kétamine (100 mg/kg) et de la xylazine (10 mg/kg), et le cœur a été perfusé successivement avec du PBS 0,1 M, puis avec du PFA à 4 % dans du PBS. Le tissu a été disséqué et fixé dans du PFA à 4 % dans du PBS pendant une nuit à 4 °C. Un couteau vibrant (Leica Microsystems GmbH, Vienne, Autriche) a été utilisé pour préparer des coupes sagittales (50 μm d'épaisseur) à partir du cerveau fixé dans du PBS. Sauf indication contraire, la coloration des coupes flottantes a été réalisée comme décrit précédemment (13) à température ambiante et sous agitation. Brièvement, les coupes obtenues ont d'abord été perméabilisées avec du Triton X-100 à 0,5 % dans du PBS pendant 15 minutes à température ambiante ; pour certains épitopes (Pcx et Shmt2), cette étape a été remplacée par un chauffage des coupes pendant 25 minutes dans un tampon Tris-EDTA à 80 °C (pH 9). Les coupes ont ensuite été incubées avec l'anticorps primaire (voir tableau S1) dans un tampon de blocage (BSA 3 %/PBS) à 4 °C pendant une nuit sous agitation. Le lendemain, après lavage avec le tampon de blocage, les coupes ont été incubées avec l'anticorps secondaire conjugué au fluorophore approprié pendant 2 heures à température ambiante. Enfin, après lavage abondant au PBS, les coupes ont été contre-colorées au DAPI, puis fixées sur une lame de microscope avec AquaPolymount.
Un microscope confocal à balayage laser (TCS SP8-X ou TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) équipé d'un laser à lumière blanche et d'un laser ultraviolet à diode de 405 nm a été utilisé pour l'imagerie de l'échantillon. L'excitation du fluorophore et la collecte du signal par des détecteurs hybrides (HyD) ont permis d'acquérir des images empilées, conformément à l'échantillonnage de Nyquist, en mode séquentiel grâce au logiciel LAS-X. Pour les panels non quantitatifs, notamment les signaux très dynamiques (par exemple, dans les cellules somatiques et les dendrites), le nombre de progéniteurs neuronaux (PN) a été déterminé à l'aide d'HyD en mode BrightR. Un seuillage temporel de 0,3 à 6 ns a été appliqué afin de réduire le bruit de fond.
Imagerie en temps réel des cellules triées. Après tri dans un milieu Neurobasal-A contenant 1 % de supplément B27 et 0,5 mM de GlutaMax, les cellules ont été immédiatement ensemencées sur des lames de verre recouvertes de poly-L-lysine (μ-Slide8 Well, Ibidi, réf. 80826), puis incubées à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 1 heure pour permettre leur adhésion. L'imagerie en temps réel a été réalisée à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser Leica SP8 équipé d'un laser blanc, d'un système HyD, d'un objectif à immersion d'huile 63× (ouverture numérique [ON] de 1,4) et d'une platine chauffante.
La souris a été rapidement anesthésiée au dioxyde de carbone et décapitée, le cerveau a été rapidement retiré du crâne et coupé en sections sagittales de 200 μm d'épaisseur (pour l'expérience de marquage au 13C) ou de 275 μm d'épaisseur (pour les expériences à deux photons) remplies des matériaux suivants : La crème glacée (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Allemagne) est remplie des substances suivantes : 125 mM de liquide céphalo-rachidien artificiel (LCRa) glacé, saturé en carbone (95 % O2 et 5 % CO2), faible en Ca2+, NaCl 2,5 mM, KCl 1,25 mM, tampon phosphate de sodium 1,25 mM, NaHCO3 25 mM, glucose 25 mM, CaCl2 0,5 mM et MgCl2 3,5 mM (pression osmotique de 310 à 330 mmol). Transférez les tranches de cerveau obtenues dans une chambre de pré-incubation contenant un milieu ACSF à plus forte concentration de Ca2 + (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampon phosphate de sodium, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucose, 1,0 mM CaCl2 et 2,0 mM MgCl2) pH 7,4 et 310 à 320 mmol).
Lors de l'acquisition d'images, les coupes ont été transférées dans une salle d'imagerie dédiée et l'expérience a été réalisée sous perfusion continue de LCR artificiel (ACSF) à une température constante de 32 à 33 °C. Un microscope confocal à balayage laser multiphotonique (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) équipé d'un objectif Leica 25x (NA 0,95, immersion dans l'eau) et d'un laser Ti:Saphir (Chameleon Vision II, Coherent) a été utilisé pour l'imagerie des coupes. Module FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
Imagerie FLIM de Grx1-roGFP2. Les variations de l'état redox cytoplasmique des neurones pyramidaux (PN) ont été mesurées par FLIM biphotonique sur des coupes sagittales de cerveau, où le biocapteur Grx1-roGFP2 ciblait les PN. Dans la couche des PN, le champ d'acquisition a été sélectionné à environ 50 à 80 μm sous la surface de la coupe afin de garantir la présence d'un PN viable (absence de structure perlée ou de modifications morphologiques neuronales le long des dendrites) et du biocapteur roGFP2 doublement positif ainsi que de l'AAV codant pour l'ARNsh PCx ou sa séquence contrôle (co-exprimant chacun mCherry). Des images mono-pile ont été acquises avec un zoom numérique 2x [longueur d'onde d'excitation : 890 nm ; résolution : 512 nm, 512 pixels]. Détection : l’imagerie par résonance magnétique (IRM) interne (HyD), le groupe de filtres à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et le moyennage d’images sur une période de 2 à 3 minutes permettent de collecter un nombre suffisant de photons (1 000 au total) pour l’ajustement de la courbe. La sensibilité de la sonde Grx1-roGFP2 et la vérification des conditions FLIM ont été réalisées en surveillant la durée de vie de la sonde roGFP2 après ajout de 10 mM de H₂O₂ exogène à la solution ACSF de perfusion (pour maximiser l’oxydation et augmenter la durée de vie), puis après ajout de 2 mM de dithiothréitol (pour minimiser la réduction et diminuer la durée de vie) (Figure S8, D à G). Le logiciel FLIMfit 5.1.1 a été utilisé pour analyser les résultats acquis et ajuster la courbe de décroissance exponentielle simple de l’image entière à la fonction de réponse instrumentale (IRF) mesurée. Le χ² est alors proche de 1. Pour calculer la durée de vie d’un neurone périphérique (PN), un masque a été tracé manuellement autour du corps nerveux et la durée de vie moyenne dans chaque masque a été utilisée pour la quantification.
Analyse du potentiel mitochondrial. Après incubation de la section aiguë avec 100 nM de TMRM ajoutés directement au LCR perfusé pendant 30 minutes, les variations du potentiel mitochondrial des cellules de Purkinje ont été mesurées par microscopie biphotonique. L'imagerie TMRM a été réalisée en excitant la sonde à 920 nm et en utilisant un détecteur interne HyD (isothiocyanate de tétraméthylrhodamine : 585/40 nm) pour collecter les signaux ; en utilisant la même longueur d'onde d'excitation mais un détecteur interne HyD différent (FITC : 525/50) pour l'imagerie mtYFP. Le potentiel mitochondrial a été évalué au niveau de la cellule unique à l'aide du plugin Image Calculator d'ImageJ. En résumé, l'équation du plugin : signal = min (mtYFP, TMRM) permet d'identifier la région mitochondriale présentant le signal TMRM dans la cellule de Purkinje somalienne sur l'image confocale mono-pile du canal correspondant. Ensuite, la surface des pixels dans le masque résultant est quantifiée, puis normalisée sur l'image mono-empilement à seuil correspondant du canal mtYFP pour obtenir la fraction mitochondriale montrant le potentiel mitochondrial.
L'image a été déconvoluée avec le logiciel Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Pour les images numérisées de carreaux, l'assemblage d'un seul carreau est réalisé grâce à l'algorithme d'assemblage automatique du logiciel LAS-X. Après calibration de l'image, ImageJ et Adobe Photoshop sont utilisés pour le traitement ultérieur, notamment pour ajuster uniformément la luminosité et le contraste. Adobe Illustrator est utilisé pour la préparation graphique.
Analyse focale de l'ADNmt. Le nombre de lésions de l'ADNmt a été quantifié sur des coupes de cervelet marquées par des anticorps anti-ADN à l'aide d'un microscope confocal. Une zone cible a été définie pour le corps cellulaire et le noyau de chaque cellule, et leur surface respective a été calculée à l'aide du plugin Multi Measure (logiciel ImageJ). La surface cytoplasmique a été obtenue en soustrayant la surface nucléaire de la surface du corps cellulaire. Enfin, le plugin Analyze Particles (logiciel ImageJ) a été utilisé pour quantifier automatiquement les points d'ADN cytoplasmique indiquant la présence d'ADNmt sur l'image seuillée, et les résultats obtenus ont été normalisés par rapport à la moyenne PN des souris témoins (CTRL). Les résultats sont exprimés en nombre moyen de nucléosides par cellule.
Analyse de l'expression protéique. Utilisez le plugin Image Calculator d'ImageJ pour évaluer l'expression protéique dans les cellules de Purkini au niveau de la cellule unique. Brièvement, sur l'image confocale monocouche du canal correspondant, la région mitochondriale présentant une immunoréactivité à un anticorps spécifique dans les cellules de Purkini est identifiée grâce à l'équation : signal = min (mtYFP, anticorps). La surface en pixels du masque obtenu est ensuite quantifiée, puis normalisée par rapport à l'image monocouche seuillée correspondante du canal mtYFP afin d'obtenir la fraction mitochondriale de la protéine exprimée.
Analyse de la densité des cellules de Purkinje. Le module complémentaire Cell Counter d'ImageJ a été utilisé pour évaluer la densité des cellules de Purkinje en divisant le nombre de cellules de Purkinje comptées par la longueur de l'anneau cérébelleux occupé par ces cellules.
Préparation et prélèvement des échantillons. Les cerveaux des souris témoins et des souris Mfn2cKO ont été fixés dans une solution de PFA à 2 % et de glutaraldéhyde à 2,5 % dans un tampon phosphate 0,1 M (PB). Des coupes coronales de 50 à 60 µm d'épaisseur ont ensuite été réalisées à l'aide d'un ciliateur (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienne, Autriche). Ces coupes ont été fixées dans un tampon PB contenant 1 % de tétroxyde d'azote et 1,5 % de ferrocyanure de potassium à température ambiante pendant 1 heure. Après trois lavages à l'eau distillée, les coupes ont été colorées à l'éthanol à 70 % contenant 1 % d'acétate d'uranyle pendant 20 minutes. Elles ont ensuite été déshydratées dans des bains d'alcool de concentration croissante et incluses dans la résine époxy Durcupan ACM (résine de coulée Araldite M) (Electron Microscopy Sciences, référence 14040) entre deux lames de verre siliconées. La polymérisation a été effectuée à 60 °C pendant 48 heures. La région du cortex cérébelleux a été sélectionnée et des coupes ultrafines de 50 nm ont été réalisées à l'aide d'un ultramicrotome Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienne, Autriche) et déposées sur une grille à fentes de cuivre de 2 × 1 mm recouverte d'un film de polystyrène. Les coupes ont été colorées avec une solution d'acétate d'uranyle à 4 % dans l'eau pendant 10 minutes, rincées plusieurs fois à l'eau, puis avec du citrate de plomb de Reynolds dans l'eau pendant 10 minutes, et enfin rincées plusieurs fois à l'eau. Les micrographies ont été acquises à l'aide d'un microscope électronique à transmission Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis) équipé d'une caméra numérique TVIPS TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, Allemagne).
Chez les souris infectées par l'AAV, le cerveau a été prélevé et découpé en sections sagittales de 1 mm d'épaisseur. Le cervelet a ensuite été examiné au microscope à fluorescence afin d'identifier l'anneau infecté par l'AAV (exprimant la protéine mCherry). Seules les expériences où l'injection d'AAV induit une transduction très efficace de la couche de cellules de Purkinje (quasi-totalité de la couche) dans au moins deux anneaux cérébelleux consécutifs ont été retenues. L'anneau transduit par l'AAV a été microdisséqué et fixé pendant une nuit (4 % de PFA et 2,5 % de glutaraldéhyde dans un tampon cocoate 0,1 M), puis traité ultérieurement. Pour l'inclusion en EPON, le tissu fixé a été lavé avec un tampon cocoate de sodium 0,1 M (Applichem), puis incubé avec 2 % d'OsO₄ (os, Science Services ; Caco) dans un tampon cocoate de sodium 0,1 M (Applichem) pendant 4 heures, puis lavé pendant 2 heures. Cette opération a été répétée 3 fois avec un tampon cocamide 0,1 M. Par la suite, une série de bains d'éthanol de concentration croissante a été utilisée pour incuber chaque solution à 4 °C pendant 15 minutes afin de déshydrater le tissu. Ce dernier a ensuite été transféré dans de l'oxyde de propylène et incubé une nuit dans de l'EPON (Sigma-Aldrich) à 4 °C. Après incubation dans de l'EPON frais à température ambiante pendant 2 heures, le tissu a été inclus à 62 °C pendant 72 heures. Des coupes ultrafines de 70 nm ont été réalisées à l'aide d'un ultramicrotome (Leica Microsystems, UC6) et d'un couteau diamant (Diatome, Bienne, Suisse). Ces coupes ont été colorées à l'acétate d'uranyle à 1,5 % pendant 15 minutes à 37 °C, puis au citrate de plomb pendant 4 minutes. Les micrographies électroniques ont été acquises à l'aide d'un microscope électronique à transmission JEM-2100 Plus (JEOL) équipé d'une caméra OneView 4K 16 bits (Gatan) et du logiciel DigitalMicrograph (Gatan). Pour l'analyse, des micrographies électroniques ont été acquises avec un zoom numérique de 5000× ou 10 000×.
Analyse morphologique des mitochondries. Pour toutes les analyses, les contours de chaque mitochondrie ont été tracés manuellement sur des images numériques à l'aide du logiciel ImageJ. Différents paramètres morphologiques ont été analysés. La densité mitochondriale est exprimée en pourcentage, obtenu en divisant la surface mitochondriale totale de chaque cellule par la surface du cytoplasme (surface du cytoplasme = surface cellulaire - surface du noyau) × 100. La circularité des mitochondries a été calculée selon la formule [4π × (surface / périmètre²)]. La morphologie interne des mitochondries a été analysée et classée en deux catégories (« tubulaire » et « vésiculaire ») selon leur forme principale.
Analyse du nombre et de la densité des autophagosomes/lysosomes. Utilisez le logiciel ImageJ pour délimiter manuellement les contours de chaque autophagosome/lysosome sur l'image numérique. La surface occupée par les autophagosomes/lysosomes est exprimée en pourcentage, calculé en divisant la surface totale des structures autophagosomes/lysosomes de chaque cellule par la surface du cytoplasme (surface du cytoplasme = surface cellulaire - surface du noyau) × 100. La densité des autophagosomes/lysosomes est calculée en divisant leur nombre total par le nombre de structures autophagosomes/lysosomes par cellule (exprimé en surface cytoplasmique) (surface cytoplasmique = surface cellulaire - surface du noyau).
Marquage pour la coupe et la préparation des échantillons. Pour les expériences nécessitant un marquage au glucose, transférer les tranches de cerveau aiguës dans une chambre de pré-incubation contenant du carbone saturé (95 % d'O2 et 5 % de CO2), une solution ACSF riche en Ca2+ (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, tampon phosphate de sodium 1,25 mM, NaHCO3 25,0 mM, d-glucose 25,0 mM, CaCl2 1,0 mM et MgCl2 2,0 mM, pH ajusté à 7,4 et osmolarité de 310 à 320 mOsm), dans laquelle le glucose est du 13C6-Glucose (Eurisotop, référence CLM-1396). Pour les expériences nécessitant un marquage au pyruvate, transférer les tranches de cerveau aiguës dans une solution ACSF à concentration élevée de Ca²⁺ (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, tampon phosphate de sodium 1,25 mM, 25,0 mM NaHCO₃, 25,0 mM d-glucose, 1,0 mM CaCl₂ et 2,0 mM MgCl₂, ajuster le pH à 7,4 et l'osmolalité entre 310 et 320 mOsm), puis ajouter 1 mM de 1-[1-¹³C]pyruvate (Eurisotop, référence CLM-1082). Incuber les tranches pendant 90 minutes à 37 °C. À la fin de l'expérience, les sections ont été rapidement lavées avec une solution aqueuse (pH 7,4) contenant 75 mM de carbonate d'ammonium, puis homogénéisées dans un mélange 40:40:20 (v/v/v) d'acétonitrile (ACN), de méthanol et d'eau. Après une incubation de 30 minutes sur glace, les échantillons ont été centrifugés à 21 000 g pendant 10 minutes à 4 °C, et le surnageant clair a été séché sous vide (SpeedVac). Le culot de métabolites séchés obtenu a été conservé à -80 °C jusqu'à l'analyse.
Analyse par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse des acides aminés marqués au 13C. Pour l'analyse par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS), le culot de métabolites a été remis en suspension dans 75 μl d'eau de qualité LC-MS (Honeywell). Après centrifugation à 21 000 g pendant 5 minutes à 4 °C, 20 μl du surnageant clarifié ont été utilisés pour l'analyse du flux d'acides aminés, tandis que le reste de l'extrait a été immédiatement utilisé pour l'analyse des anions (voir ci-dessous). L'analyse des acides aminés a été réalisée selon le protocole de dérivatisation au chlorure de benzoyle décrit précédemment (55, 56). Dans un premier temps, 10 μl de carbonate de sodium 100 mM (Sigma-Aldrich) ont été ajoutés à 20 μl d'extrait de métabolites, puis 10 μl de chlorure de benzoyle à 2 % (Sigma-Aldrich) ont été ajoutés à l'acétonitrile de qualité LC. L'échantillon a été brièvement vortexé puis centrifugé à 21 000 g pendant 5 minutes à 20 °C. Le surnageant clarifié a été transféré dans un flacon de 2 ml pour échantillonneur automatique muni d'un insert conique en verre (volume de 200 µl). Les échantillons ont été analysés par chromatographie liquide ultra-performante (UHPLC) à l'aide du système Acquity iClass (Waters), couplé à un spectromètre de masse haute résolution de précision Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Pour l'analyse, 2 µl de l'échantillon dérivatisé ont été injectés dans une colonne de silice T3 haute résistance de 100 × 1,0 mm (Waters) contenant des particules de 1,8 µm. Le débit est de 100 µl/min et le système tampon est composé du tampon A (formiate d'ammonium 10 mM et acide formique 0,15 % dans l'eau) et du tampon B (acétonitrile). Le gradient est le suivant : 0 % B à 0 minute ; 0 % B. 0 à 15 % B de 0 à 0,1 minutes ; 15 à 17 % B de 0,1 à 0,5 minutes ; B de 17 à 55 % de 0,5 à 14 minutes ; B de 55 à 70 % de 14 à 14,5 minutes ; de 14,5 à 70 à 100 % B à 18 minutes ; 100 % B de 18 à 19 minutes ; 100 à 0 % B de 19 à 19,1 minutes ; 0 % B de 19,1 à 28 minutes (55, 56). Le spectromètre de masse QE-HF fonctionne en mode d'ionisation positive avec une gamme de masse m/z (rapport masse/charge) de 50 à 750. La résolution appliquée est de 60 000, la cible d'ions obtenue par contrôle de gain (AGC) est de 3 × 10⁶ et le temps d'acquisition maximal des ions est de 100 millisecondes. La source d'ionisation par électrospray (ESI) chauffée fonctionne à une tension de pulvérisation de 3,5 kV, une température capillaire de 250 °C, un débit d'air de gaine de 60 UA (unités arbitraires) et un débit d'air auxiliaire de 20 UA. La lentille S est réglée à 60 UA.
Analyse par chromatographie anionique couplée à la spectrométrie de masse (CAM) d'acides organiques marqués au 13C. Le précipité de métabolites restant (55 μl) a été analysé par un système de chromatographie ionique Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) couplé à un spectromètre de masse QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Brièvement, 5 μl d'extrait de métabolites ont été injectés dans une colonne Dionex IonPac AS11-HC équipée d'un système HPLC (2 mm × 250 mm, granulométrie 4 μm, Thermo Fisher Scientific) en mode boucle partielle avec un taux de remplissage de 1. Une colonne de garde Dionex IonPac AG11-HC (2 mm × 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific) a été utilisée. La température de la colonne a été maintenue à 30 °C et celle de l'échantillonneur automatique à 6 °C. Un gradient d'hydroxyde de potassium a été généré par le générateur d'éluant à l'aide d'une cartouche d'hydroxyde de potassium remplie d'eau désionisée. La séparation des métabolites a été réalisée à un débit de 380 μl/min, en appliquant le gradient suivant : 0 à 3 minutes, KOH 10 mM ; 3 à 12 minutes, KOH 10 à 50 mM ; 12 à 19 minutes, KOH 50 à 100 mM ; 19 à 21 minutes, KOH 100 mM ; 21 à 21,5 minutes, KOH 100 à 10 mM. La colonne a ensuite été rééquilibrée sous KOH 10 mM pendant 8,5 minutes.
Les métabolites élués sont combinés à un flux d'isopropanol de 150 μl/min après la colonne, puis dirigés vers un spectromètre de masse haute résolution fonctionnant en mode d'ionisation négative. Le spectromètre de masse analyse la gamme de masse de m/z 50 à 750 avec une résolution de 60 000. Le contrôle automatique de gain (AGC) est réglé à 1 × 10⁶ et le temps d'acquisition maximal des ions est maintenu à 100 ms. La source ESI chauffée fonctionne à une tension de pulvérisation de 3,5 kV. Les autres paramètres de la source d'ions sont les suivants : température du capillaire : 275 °C ; débit de gaz de gaine : 60 UA ; débit de gaz auxiliaire : 20 UA à 300 °C ; et réglage de la lentille S : 60 UA.
Analyse des données des métabolites marqués au 13C. Le logiciel TraceFinder (version 4.2, Thermo Fisher Scientific) a été utilisé pour l'analyse des rapports isotopiques. L'identité de chaque composé a été vérifiée par comparaison avec un composé de référence fiable et analysée indépendamment. Pour l'analyse d'enrichissement isotopique, l'aire du chromatogramme d'ions extraits (XIC) de chaque isotope du 13C (13Mn) a été extraite de [M + H]+, où n représente le nombre de carbones du composé cible (utilisé pour l'analyse des acides aminés) ou de [MH]+ (utilisé pour l'analyse des anions). La précision de masse du XIC est inférieure à 5 ppm et la précision du temps de rétention (TR) est de 0,05 min. L'analyse d'enrichissement est réalisée en calculant le rapport de chaque isotope détecté à la somme de tous les isotopes du composé correspondant. Ces rapports sont exprimés en pourcentage pour chaque isotope et les résultats en pourcentage molaire d'enrichissement (PME), comme décrit précédemment (42).
Le culot neuronal congelé a été homogénéisé dans du méthanol à 80 % (v/v) glacé, vortexé, puis incubé à -20 °C pendant 30 minutes. Après un nouveau vortexage, l'échantillon a été incubé à +4 °C pendant 30 minutes. Il a ensuite été centrifugé à 21 000 g pendant 5 minutes à 4 °C, et le surnageant obtenu a été recueilli et séché sous vide (SpeedVac) à 25 °C en vue d'analyses ultérieures. Comme décrit précédemment, une analyse LC-MS a été réalisée sur les acides aminés des cellules triées. L'analyse des données a été effectuée à l'aide du logiciel TraceFinder (version 4.2, Thermo Fisher Scientific) en utilisant la masse monoisotopique de chaque composé. La normalisation quantile des données métaboliques a été réalisée avec le logiciel preprocessCore (57).
Préparation des tranches. La souris a été rapidement anesthésiée au dioxyde de carbone et décapitée, le cerveau a été rapidement retiré du crâne, et le couteau vibrant rempli de glace (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Allemagne) a été utilisé pour le découper en sections sagittales de 300 à 375 μm. Gazéification au carbone froid (95 % O2 et 5 % CO2). ACSF à faible concentration de Ca2+ (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, tampon phosphate de sodium 1,25 mM, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucose, 1,0 mM CaCl2 et 6,0 mM MgCl2). Ajustement du pH à 7,4 et de l'osmolarité à 310 à 330 mOsm. Transférez les tranches de cerveau obtenues dans une chambre contenant une solution ACSF à concentration élevée de Ca2+ (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, tampon phosphate de sodium 1,25 mM, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucose, 4,0 mM CaCl2 et 3,5 mM MgCl2, pH 7,4 et osmolarité de 310 à 320 mOsm). Laissez les tranches s'incuber pendant 20 à 30 minutes afin qu'elles puissent se rétablir avant l'enregistrement.
Enregistrement. Une platine de microscope équipée d'une chambre d'enregistrement fixe et d'un objectif à immersion dans l'eau 20x (Scientifica) a été utilisée pour tous les enregistrements. Les cellules de Purkinje putatives ont été identifiées par (i) leur taille, (ii) leur localisation anatomique dans le cervelet et (iii) l'expression du gène rapporteur fluorescent mtYFP. La pipette patch, d'une résistance de pointe de 5 à 11 mégohms, est extraite à l'aide d'un capillaire en verre borosilicaté (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Allemagne) et d'un pipeteur horizontal (P-1000, Sutter, Novato, CA). Tous les enregistrements ont été réalisés avec un amplificateur patch-clamp ELC-03XS npi (npi electronic GmbH, Tam, Allemagne), piloté par le logiciel Signal (version 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Royaume-Uni). L'expérience a été enregistrée à une fréquence d'échantillonnage de 12,5 kHz. Le signal est filtré par deux filtres passe-bas de Bessel, de fréquences de coupure respectives de 1,3 et 10 kHz. La capacité de la membrane et de la pipette est compensée par le circuit de compensation de l'amplificateur. Toutes les expériences ont été réalisées sous le contrôle d'une caméra Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Allemagne), pilotée par le logiciel Hokawo (version 2.8, Hamamatsu, Gerden, Allemagne).
Configuration et analyse de routine en configuration cellule entière. Juste avant l'enregistrement, remplir la pipette avec la solution interne contenant les substances suivantes : 4,0 mM de KCl, 2,0 mM de NaCl, 0,2 mM d'EGTA, 135,0 mM de gluconate de potassium, 10,0 mM d'Hepes, 4,0 mM d'ATP (Mg), 0,5 mM de guanosine triphosphate (GTP) (Na) et 10,0 mM de créatine phosphate. Le pH est ajusté à 7,25 et la pression osmotique à 290 mOsm (saccharose). Immédiatement après l'application d'une force de 0 pA pour rompre la membrane, le potentiel de membrane au repos est mesuré. La résistance d'entrée est mesurée en appliquant des courants hyperpolarisés de -40, -30, -20 et -10 pA. Mesurer l'amplitude de la réponse en tension et utiliser la loi d'Ohm pour calculer la résistance d'entrée. L'activité spontanée a été enregistrée en voltage imposé pendant 5 minutes. Les courants postsynaptiques spontanés (sPSC) ont été identifiés et mesurés à l'aide du logiciel Igor Pro (version 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, États-Unis) grâce à un script de reconnaissance semi-automatique. La courbe courant-tension (I-V) et le courant à l'état stationnaire ont été mesurés en plaquant la batterie à différents potentiels (à partir de -110 mV) et en augmentant la tension par paliers de 5 mV. La production de potentiels d'action (PA) a été testée par l'application d'un courant dépolarisant. La cellule a été plafonnée à -70 mV lors de l'application d'une impulsion de courant dépolarisante. L'amplitude du pas d'impulsion a été ajustée individuellement pour chaque unité d'enregistrement (de 10 à 60 pA). La fréquence maximale des PA a été calculée en comptant manuellement les pics d'impulsion qui la provoquent. Le seuil de déclenchement des PA a été analysé à partir de la dérivée seconde de l'impulsion de dépolarisation qui induit un ou plusieurs PA.
Configuration et analyse de la technique du patch perforé. Réaliser un enregistrement en patch perforé selon les protocoles standards. Utiliser une pipette sans ATP ni GTP, ne contenant pas les ingrédients suivants : gluconate de potassium 128 mM, KCl 10 mM, Hepes 10 mM, EGTA 0,1 mM et MgCl₂ 2 mM, et ajuster le pH à 7,2 (avec du KOH). L’ATP et le GTP sont omis de la solution intracellulaire afin de prévenir une perméabilité membranaire incontrôlée. La pipette de patch est remplie d’une solution interne contenant de l’amphotéricine (environ 200 à 250 µg/ml ; G4888, Sigma-Aldrich) pour obtenir un enregistrement en patch perforé. L’amphotéricine est dissoute dans du diméthylsulfoxyde (concentration finale : 0,1 à 0,3 % ; DMSO ; D8418, Sigma-Aldrich). La concentration de DMSO utilisée n’a pas d’effet significatif sur les neurones étudiés. Durant la procédure de perforation, la résistance du canal (Ra) a été surveillée en continu et l'expérience a débuté après stabilisation de l'amplitude de Ra et du potentiel d'action (PA) (20 à 40 minutes). L'activité spontanée a été mesurée en mode voltage-clamp et/ou courant-clamp pendant 2 à 5 minutes. L'analyse des données a été réalisée à l'aide des logiciels Igor Pro (version 7.05.2, WaveMetrics, États-Unis), Excel (version 2010, Microsoft Corporation, Redmond, États-Unis) et GraphPad Prism (version 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, Californie, États-Unis). Le module complémentaire NeuroMatic v3.0c d'Igor Pro a été utilisé pour identifier les PA spontanés. Ce module identifie automatiquement les PA à l'aide d'un seuil donné, ajusté individuellement pour chaque enregistrement. La fréquence des potentiels d'action a été déterminée à partir de l'intervalle entre les potentiels d'action, en calculant la fréquence maximale instantanée et la fréquence moyenne.
Isolement des neurones de projection (PN). En adaptant le protocole précédemment publié, les PN ont été purifiés à partir du cervelet de souris à un stade précis (58). Brièvement, le cervelet a été disséqué et broyé dans un milieu de dissociation glacé [sans HBSS, Ca2+ ni Mg2+, supplémenté avec 20 mM de glucose, de la pénicilline (50 U/ml) et de la streptomycine (0,05 mg/ml)], puis le milieu a été digéré dans de la papaïne [HBSS, supplémenté avec du chlorhydrate de L-cystéine (1 mg/ml), de la papaïne (16 U/ml) et de la désoxyribonucléase I (DNase I ; 0,1 mg/ml)]. Le traitement a été effectué pendant 30 minutes à 30 °C. Tout d'abord, laver les tissus dans un milieu HBSS contenant du mucus d'œuf (10 mg/ml), de la BSA (10 mg/ml) et de la DNase (0,1 mg/ml) à température ambiante afin d'empêcher la digestion enzymatique, puis dans un milieu HBSS contenant 20 mM de glucose. Un broyage doux dans du HBSS, de la pénicilline (50 U/ml), de la streptomycine (0,05 mg/ml) et de la DNase (0,1 mg/ml) permet de libérer les cellules individuelles. La suspension cellulaire obtenue est filtrée à travers un filtre cellulaire de 70 μm, puis les cellules sont pelletées par centrifugation (1110 tr/min, 5 minutes, 4 °C) et remises en suspension dans un milieu de tri [HBSS, supplémenté avec 20 mM de glucose, 20 % de sérum de veau fœtal, de la pénicilline (50 U/ml) et de la streptomycine (0,05 mg/ml)]. Évaluer la viabilité cellulaire par marquage à l'iodure de propidium et ajuster la densité cellulaire entre 1 × 10⁶ et 2 × 10⁶ cellules/ml. Avant la cytométrie en flux, la suspension a été filtrée à travers un filtre cellulaire de 50 μm.
Cytomètre de flux. Le tri cellulaire a été réalisé à 4 °C à l'aide d'un cytomètre FACSAria III (BD Biosciences) et du logiciel FACSDiva (BD Biosciences, version 8.0.1). La suspension cellulaire a été triée à l'aide d'une buse de 100 μm sous une pression de 20 psi à une fréquence d'environ 2 800 événements/s. Les critères de sélection traditionnels (taille cellulaire, discrimination bimodale et caractéristiques de diffusion) ne permettant pas d'isoler correctement les neurones pyramidaux (PN) des autres types cellulaires, la stratégie de sélection a été définie par comparaison directe de l'intensité de la fluorescence YFP et de l'autofluorescence chez les souris mitoYFP+ ​​et les souris témoins mitoYFP−. La fluorescence YFP est excitée par irradiation de l'échantillon avec un laser à 488 nm, et le signal est détecté à l'aide d'un filtre passe-bande 530/30 nm. Chez les souris mitoYFP+, l'intensité relative du gène rapporteur Rosa26-mitoYFP est également utilisée pour distinguer les corps cellulaires neuronaux et les fragments d'axones. Le 7-AAD est excité par un laser jaune de 561 nm et détecté à l'aide d'un filtre passe-bande 675/20 nm afin d'exclure les cellules mortes. Pour isoler simultanément les astrocytes, la suspension cellulaire est marquée à l'ACSA-2-APC, puis l'échantillon est irradié par un laser à 640 nm. Le signal est ensuite détecté à l'aide d'un filtre passe-bande 660/20 nm.
Les cellules collectées ont été concentrées par centrifugation (1110 tr/min, 5 minutes, 4 °C) et conservées à -80 °C jusqu'à leur utilisation. Les souris Mfn2cKO et leurs petits ont été classés le même jour afin de minimiser la variabilité liée à la procédure. L'analyse et la présentation des données de cytométrie de flux ont été réalisées à l'aide du logiciel FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, États-Unis).
Comme mentionné précédemment (59), la PCR en temps réel est utilisée pour isoler l'ADN des neurones triés en vue de la quantification ultérieure de l'ADNmt. La linéarité et la sensibilité du seuil ont été initialement testées en réalisant une qPCR sur différents nombres de cellules. Brièvement, 300 neurones primaires (PN) sont collectés dans un tampon de lyse composé de Tris-HCl 50 mM (pH 8,5), d'EDTA 1 mM, de Tween 20 à 0,5 % et de protéinase K (200 ng/ml), puis incubés à 55 °C pendant 120 minutes. Les cellules sont ensuite incubées à 95 °C pendant 10 minutes supplémentaires afin d'assurer l'inactivation complète de la protéinase K. L'ADNmt est quantifié par PCR semi-quantitative à l'aide d'une sonde TaqMan (Thermo Fisher) spécifique de mt-Nd1, sur un système de PCR en temps réel 7900HT (Thermo Fisher Scientific). Gènes Science (numéro de catalogue Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, numéro de catalogue AIVI3E8) et 18S (Thermo Fisher Scientific, numéro de catalogue Hs99999901_s1).
Préparation des échantillons de protéome. La solution est chauffée à 95 °C pendant 10 minutes, puis soniquée dans le tampon de lyse [chlorure de guanidine 6 M, chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine 10 mM, chloroacétamide 10 mM et Tris-HCl 100 mM]. Lyse des culots neuronaux congelés dans du Tris-HCl 100 mM sur un Bioruptor (Diagenode) pendant 10 minutes (30 secondes d'impulsion / 30 secondes de pause). L'échantillon est dilué 1:10 dans du Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), mélangé à 300 ng de trypsine Gold (Promega) et incubé une nuit à 37 °C pour une digestion complète. Le lendemain, l'échantillon est centrifugé à 20 000 g pendant 20 minutes. Le surnageant est dilué avec de l'acide formique à 0,1 % et la solution est dessalée à l'aide de StageTips fabriqués sur mesure. L'échantillon a été séché sous vide (SpeedVac, Eppendorf Concentrator Plus 5305) à 45 °C, puis le peptide a été mis en suspension dans de l'acide formique à 0,1 %. Tous les échantillons ont été préparés simultanément par la même personne. Pour l'analyse des échantillons d'astrocytes, 4 μg de peptides désalés ont été marqués par spectrométrie de masse en tandem (TMT10plex, réf. 90110, Thermo Fisher Scientific) selon un rapport peptide/réactif TMT de 1:20. Pour le marquage TMT, 0,8 mg de réactif TMT ont été remis en suspension dans 70 μl d'acétonitrile anhydre (ACN), et le peptide séché a été reconstitué dans 9 μl de bicarbonate de triéthylammonium (TEAB) 0,1 M, auxquels ont été ajoutés 7 μl de réactif TMT dans l'ACN. La concentration finale était de 43,75 %. Après 60 minutes d'incubation, la réaction a été stoppée par addition de 2 μl d'hydroxylamine à 5 %. Les peptides marqués ont été recueillis, séchés, remis en suspension dans 200 μl d'acide formique à 0,1 %, divisés en deux, puis dessalés à l'aide de StageTips fabriqués sur mesure. L'une des deux moitiés a été fractionnée par chromatographie liquide ultra-performante (UltiMate 3000) sur une colonne chromatographique Acquity (1 mm × 150 mm) remplie de particules C18 de 130 Å et 1,7 μm (Waters, réf. : 186006935 ; Thermo Fisher Scientific). Séparer les peptides à un débit de 30 μl/min, par gradient de 1 % à 50 % de tampon B pendant 85 minutes (gradué par paliers de 96 minutes), puis de 50 % à 95 % de tampon B pendant 3 minutes, et enfin maintenir ce gradient à 95 % de tampon B pendant 8 minutes. Le tampon A est composé de 5 % d'acétonitrile (ACN) et de 10 mM de bicarbonate d'ammonium (ABC), et le tampon B de 80 % d'ACN et de 10 mM d'ABC. Collecter les fractions toutes les 3 minutes, les regrouper en deux (1 + 17, 2 + 18, etc.) et les sécher sous vide par centrifugation.
Analyse LC-MS/MS. Pour la spectrométrie de masse, les peptides (numéro r119.aq) ont été séparés sur une colonne analytique PicoFrit de 25 cm de longueur et de 75 μm de diamètre interne (objectif neuf, référence PF7508250) équipée d'un support ReproSil-Pur 120 C18-AQ de 1,9 μm (Dr. Maisch, mat), à l'aide d'un système EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Allemagne). La colonne a été maintenue à 50 °C. Les tampons A et B sont respectivement composés d'acide formique à 0,1 % dans l'eau et d'acide formique à 0,1 % dans 80 % d'acétonitrile. La séparation des peptides a été réalisée par gradient de 6 % à 31 % de tampon B pendant 65 minutes, puis de 31 % à 50 % de tampon B pendant 5 minutes, avec un débit de 200 nl/min. Les peptides élués ont été analysés par spectrométrie de masse sur un spectromètre Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). La mesure du rapport masse sur charge (m/z) des précurseurs peptidiques a été réalisée avec une résolution de 120 000 dans la gamme de 350 à 1 500 m/z. En utilisant une énergie de collision normalisée de 27 %, le précurseur le plus ionisé, présentant un état de charge de 2 à 6, a été sélectionné pour la dissociation par piège ionique à haute énergie (HCD). Le temps de cycle a été fixé à 1 s. La valeur m/z du fragment peptidique a été mesurée dans le piège ionique en utilisant la plus petite cible AGC de 5 × 10⁴ et un temps d'injection maximal de 86 ms. Après fragmentation, le précurseur a été placé sur la liste d'exclusion dynamique pendant 45 s. Les peptides marqués au TMT ont été séparés sur une colonne Acclaim PepMap de 50 cm et 75 μm (Thermo Fisher Scientific, réf. 164942), et leurs spectres de migration ont été analysés par spectrométrie de masse sur un spectromètre Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) équipé d'un système FAIMS (Thermo Fisher Scientific) fonctionnant à deux tensions de compensation de −50 et −70 V. Le spectre MS3, sélectionné en fonction du précurseur de synchronisation, a été utilisé pour la mesure du signal de l'ion rapporteur TMT. La séparation des peptides a été réalisée sur un système EASY-nLC 1200, avec une élution par gradient linéaire à 90 %, et une concentration de tampon variant de 6 % à 31 %. Le tampon A était composé de 0,1 % d'acide formique (FA) et le tampon B de 0,1 % d'acide formique et de 80 % d'acétonitrile (ACN). La colonne analytique a été maintenue à 50 °C. Utilisez FreeStyle (version 1.6, Thermo Fisher Scientific) pour diviser le fichier d'origine en fonction de la tension de compensation FAIMS.
Identification et quantification des protéines. Les données originales ont été analysées à l'aide du moteur de recherche intégré Andromeda et du logiciel MaxQuant version 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Outre les séquences de la recombinase Cre et de la YFP obtenues à partir d'Aequorea victoria, les spectres de fragments peptidiques ont été comparés à la séquence canonique et à la séquence d'isoformes du protéome de référence de la souris (identifiant du protéome : UP000000589, téléchargée depuis UniProt en mai 2017). L'oxydation de la méthionine et l'acétylation N-terminale des protéines ont été définies comme modifications variables ; la carbamoylméthylation de la cystéine a été définie comme modification fixe. Les paramètres de digestion étaient définis sur « spécificité » et « trypsine/P ». Le nombre minimal de peptides et de peptides de référence utilisés pour l'identification des protéines était de 1 ; le nombre minimal de peptides uniques était de 0. Dans les conditions de correspondance avec la carte peptidique, le taux d'identification des protéines était de 0,01. L'option « Second Peptide » était activée. Utilisez l'option « correspondance entre les analyses » pour transférer les identifications réussies entre différents fichiers originaux. Utilisez un ratio minimal de 1 pour la quantification sans marquage (LFQ) (60). L'intensité LFQ est filtrée pour ne retenir qu'au moins deux valeurs valides dans au moins un groupe de génotypes à chaque point temporel, et est extrapolée à partir d'une distribution normale de largeur 0,3 et d'écart-type 1,8. Utilisez la plateforme de calcul Perseus (https://maxquant.net/perseus/) et R (https://r-project.org/) pour analyser les résultats LFQ. Un test t bilatéral à valeurs modérées du logiciel limma a été utilisé pour l'analyse d'expression différentielle (61). L'analyse exploratoire des données est réalisée à l'aide de ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally et pheatmap. Les données protéomiques basées sur TMT ont été analysées avec MaxQuant version 1.6.10.43. Recherchez les données protéomiques brutes dans la base de données de protéomique humaine UniProt, téléchargée en septembre 2018. L'analyse inclut le facteur de correction de pureté isotopique fourni par le fabricant. Utilisez la fonction limma dans R pour l'analyse d'expression différentielle. Les données originales, les résultats de la recherche dans la base de données, ainsi que le flux de travail et les résultats de l'analyse des données sont stockés dans l'alliance ProteomeXchange, via le dépôt partenaire PRIDE, sous l'identifiant PXD019690.
Les annotations fonctionnelles enrichissent l'analyse. L'outil Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) a été utilisé pour déterminer la richesse des termes d'annotation fonctionnelle du jeu de données à 8 semaines (Figure 1). Brièvement, la liste quantitative des protéines obtenue par analyse LC-MS/MS (spectrométrie de masse en tandem) est utilisée avec les critères de filtrage suivants : Mus musculus est sélectionné comme espèce et fond, et la catégorie présente la valeur P ajustée par Benjamini pour un enrichissement inférieur ou égal à 0,05, considérée comme significative. Sur ce graphique, les cinq catégories les plus enrichies dans chaque cluster, en fonction de la valeur P ajustée, sont affichées. À l'aide d'un test t multiple, avec le programme de boost linéaire en deux étapes de Benjamini, Krieger et Yekutieli (Q = 5 %), une analyse de l'expression protéique au cours du temps est réalisée sur les candidats importants identifiés dans chaque catégorie, et chaque ligne est analysée séparément. Il n'est pas nécessaire d'adopter un écart-type constant.
Afin de comparer les résultats de cette étude avec les bases de données publiées et de générer un diagramme de Venn (Figure 1), nous avons combiné la liste quantitative des protéines avec les annotations MitoCarta 2.0 (24). Utilisez l'outil en ligne Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) pour générer le diagramme.
Pour des informations détaillées sur les procédures statistiques utilisées pour l'analyse protéomique, veuillez consulter la section correspondante de la partie « Matériels et méthodes ». Pour toutes les autres expériences, des informations détaillées sont disponibles dans la légende correspondante. Sauf indication contraire, toutes les données sont exprimées sous forme de moyenne ± erreur standard à la moyenne (SEM), et toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel GraphPad Prism 8.1.2.
Pour consulter les documents complémentaires relatifs à cet article, veuillez vous rendre à l'adresse suivante : http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Cet article est en libre accès et distribué selon les termes de la licence Creative Commons Attribution - Pas d’Utilisation Commerciale, qui autorise l’utilisation, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l’utilisation finale ne soit pas à but lucratif et que l’œuvre originale soit correctement reproduite. Référence.
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Par E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
L'analyse protéomique des neurones dysfonctionnels a révélé que des programmes métaboliques sont activés pour contrer la neurodégénérescence.
Par E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
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