Adresse actuelle† : OX11 0DE, Royaume-Uni, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Royaume-Uni, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
Le complexe collecteur de lumière du centre réactionnel 1 (RC-LH1) est le composant photosynthétique central des bactéries phototrophes pourpres. Nous présentons deux structures du complexe RC-LH1 de Rhodopseudomonas palustris obtenues par cryo-microscopie électronique. La structure du complexe RC-LH114-W, résolue à 2,65 Å, est composée de 14 boucles LH1 entourant le centre réactionnel (RC), interrompues par la protéine W. En revanche, le complexe sans protéine W est constitué uniquement du centre réactionnel (RC) entouré d'une boucle LH1 fermée de 16 sous-unités. La comparaison de ces structures apporte des informations sur la dynamique de la quinone au sein du complexe RC-LH1, notamment sur les changements conformationnels, jusqu'alors inconnus, lors de la liaison de la quinone au site QB du RC, ainsi que sur la localisation de sites de liaison auxiliaires pour la quinone, qui facilitent son transfert vers le RC. La structure particulière de la protéine W empêche la fermeture de la boucle LH1, créant ainsi un canal qui accélère l'échange quinone/quinolone.
L'énergie fournie par la photosynthèse permet de soutenir la quasi-totalité de la vie sur Terre et présente un fort potentiel pour la biotechnologie solaire. Tout en favorisant la photosynthèse globale, les bactéries phototrophes pourpres présentent également divers modes de production d'énergie et des capacités métaboliques variées. Elles peuvent se développer en milieu hétérotrophe à l'obscurité, se passer de la photosynthèse, fixer l'azote et le dioxyde de carbone, produire de l'hydrogène et dégrader les composés aromatiques (1-3). Pour fournir l'énergie nécessaire à ces processus, la lumière doit être convertie rapidement et efficacement en énergie chimique. Ce processus débute lorsque le complexe d'antennes de captation de la lumière absorbe la lumière et transfère l'énergie captée au centre réactionnel (CR), amorçant ainsi la séparation de charges (4-7). L'unité de base de la photosynthèse chez les bactéries phototrophes pourpres est composée d'un CR de type 2, entouré par le complexe collecteur de lumière 1 (LH1), formant le complexe central CR-LH1. Le LH1 est constitué d'un ensemble d'hétérodimères αβ incurvés, chacun liant deux molécules de chlorophylle bactérienne (BChl) a et un ou deux caroténoïdes (8-12). L'antenne LH1 la plus simple est constituée de 16 ou 17 hétérodimères αβ entourant le centre réactionnel (RC) (9-13) en une boucle fermée. Dans d'autres complexes centraux, des peptides transmembranaires interrompent la continuité de l'antenne LH1 environnante, favorisant ainsi la diffusion du quinol/quinone entre le RC et le complexe cytochrome bc1 (11, 13-15). La plante phototrophe pourpre Rhodopseudomonas (Rps.) est un organisme modèle permettant de comprendre les transferts d'énergie et d'électrons impliqués dans la photosynthèse. La première structure cristalline de Rps. palustris a été décrite. Le modèle du complexe RC-LH1 est composé d'un RC entouré de 15 boucles hétérodimériques LH1, interrompues par une protéine inconnue appelée « protéine W » (14). La protéine W a été ultérieurement identifiée comme étant RPA4402, une protéine non caractérisée de 10,5 kDa possédant trois hélices transmembranaires (TMH) prédites (16). Nous proposons de renommer le gène rpa4402 codant pour la protéine W en pufW, afin d'harmoniser sa nomenclature avec celle utilisée pour les gènes codant pour les sous-unités RC-L, M (pufL, pufM) et LH1α, β (pufA, pufB). Il est intéressant de noter que la protéine W n'est présente que dans environ 10 % des complexes RC-LH1, ce qui révèle que Rps. palustris produit deux complexes RC-LH1 différents. Nous présentons ici les structures cryo-EM à haute résolution de deux complexes centraux : l'un contenant la protéine W et 14 hétérodimères αβ, l'autre dépourvu de protéine W et présentant une boucle LH1 fermée de 16 hétérodimères. Notre structure représente une avancée majeure dans la compréhension du complexe RC-LH1 de Rps. palustris, car nous avons analysé la population homogène de chaque variant et obtenu une résolution suffisante pour identifier clairement chaque peptide, les pigments liés, ainsi que les lipides et quinones associés. La comparaison de ces structures montre que les trois protéines TMH-W, jusqu'ici absentes des autres complexes RC-LH1, forment un canal à quinones qui accélère l'échange quinone/quinolone. Plusieurs sites de liaison conservés aux lipides et aux quinones ont été identifiés, et nous avons mis en évidence un nouveau changement conformationnel suite à la combinaison de la quinone et du centre réactionnel (RC), potentiellement adapté au centre réactionnel du photosystème II (PSII) des organismes phototrophes oxygénés. Nos résultats apportent un éclairage nouveau sur la cinétique de liaison et d'échange des quinones/quinolones au sein du complexe central RC-LH1 des bactéries phototrophes pourpres.
Afin de faciliter une étude détaillée des deux complexes présents chez *Rps. palustris*, nous avons isolé chaque complexe RC-LH1 par des méthodes biochimiques. Le complexe déficient en protéine W (désigné ci-après par ΔpufW) a été purifié à partir de la souche dépourvue du gène *pufW* (16), et un seul complexe RC-LH1 peut être produit. Le complexe contenant la protéine W est produit par une souche dont la protéine W est modifiée par l'ajout d'une étiquette 10x His à son extrémité C-terminale, permettant ainsi l'association efficace du complexe contenant la protéine W avec la plupart des souches dépourvues de protéine W par immobilisation métallique. Le complexe est ensuite séparé efficacement par chromatographie d'affinité (IMAC) (16).
Comme illustré sur la figure 1, les deux complexes contiennent un centre réactionnel (RC) à trois sous-unités (RC-L, RC-M et RC-H) entouré d'une antenne LH1. La structure à 2,80 Å du complexe dépourvu de protéine W révèle 16 hétérodimères αβ formant une boucle LH1 fermée qui entoure complètement le RC ; ce complexe est désigné ci-après par RC-LH116. La structure à 2,65 Å du complexe contenant la protéine W présente un hétérodimère LH1 à 14 Å interrompu par la protéine W ; ce complexe est désigné ci-après par RC-LH114-W.
(A et B) Représentation de la surface du composé. (C et D) Pigments liés représentés par des bâtonnets. (E et F) Les complexes observés à partir de la surface cytoplasmique présentent les peptides et les sous-unités LH1 représentés schématiquement et numérotés dans le sens horaire à partir de l'espace protéine-W [conformément à la numérotation du complexe Rba sphaeroides (13)]. Pour LH1-α, la sous-unité protéique est jaune ; pour LH1-β, elle est bleue ; pour la protéine W, elle est rouge ; pour RC-H, elle est cyan ; pour RC-L, elle est orange ; pour RC-M, elle est magenta. Les cofacteurs sont représentés par des bâtonnets : le vert représente les molécules de BChl et de BPh a, le violet les caroténoïdes et le jaune l'UQ10. (G et H) Vue agrandie de l'espace protéine-W dans la région équivalente des complexes RC-LH114-W (G) et RC-LH116 (H). Les cofacteurs sont représentés sous forme de molécules occupant l'espace, la quinone chélatée en bleu. L'espace protéine-W est délimité par une ligne pointillée bleue dans (G), et les petits pores où la quinone/quinolol diffuse sur le cycle LH116 sont délimités par une ligne pointillée noire dans (H).
La figure 1 (A et B) montre le centre réactionnel (CR) entouré d'assemblages ouverts ou fermés d'hétérodimères LH1αβ, chacun liant deux molécules de BChl et un caroténoïde (figure 1, C et D). Des études antérieures ont montré que Rps est le complexe LH1. Dans la voie de biosynthèse de la xanthine de spiruline, ces espèces contiennent des populations mixtes de caroténoïdes (17). Cependant, la spiropyrroxanthine est le caroténoïde dominant et sa densité est satisfaisante. Par conséquent, nous avons choisi de modéliser la spiroxanthine à tous les sites de liaison de LH1. Les polypeptides alpha et bêta sont des hélices transmembranaires (TMH) uniques avec de courtes régions externes membranaires (figure 1, A, B, E et F). Bien que la densité des 17 résidus à l'extrémité C-terminale n'ait pas été observée, le polypeptide alpha a été clivé de Met1 à Ala46 dans les deux complexes. Le polypeptide β a été réduit de Gly4 à Tyr52 dans RC-LH116, et de Ser5 à Tyr52 dans RC-LH114-W. Aucune densité des résidus 3 ou 4 N-terminaux ni des 13 C-terminaux n'a été observée (Figure S1). L'analyse par spectrométrie de masse du complexe RC-LH1 mixte préparé à partir de la souche sauvage a montré que la région manquante résultait d'un clivage hétérologue de ces peptides (Figures S1 et S2). La formylation N-terminale de α-Met1 a également été observée (f). L'analyse a montré que le peptide α est constitué des résidus fMet1 à Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, et le peptide β des résidus Ser2 à Ala53, ce qui concorde avec la carte de densité obtenue par microscopie électronique à basse température.
La coordination des résidus α-His29 et β-His36 permet aux BChls de s'aligner face à face ; chaque hétérodimère αβ s'assemble avec ses voisins pour former une boucle ouverte (RC-LH114-W) ou une boucle fermée (RC-LH116) autour du centre réactionnel (RC). Le réseau de pigments couplés par exciton est présenté sur la figure 1, C et D. Comparée à la bande à 877 nm de RC-LH114-W, l'absorption à 880 nm de RC-LH116 présente un décalage vers le rouge de 3 nm (figure 2A). Cependant, le spectre de dichroïsme circulaire est quasiment identique (figure 2B), ce qui indique que malgré une différence notable entre les boucles ouvertes et fermées, l'environnement local des BChls est très similaire. Ce décalage vers le rouge pourrait résulter d'une agitation thermique réduite et d'une stabilité accrue au niveau de la boucle fermée (18, 19), d'une modification du couplage pigmentaire induite par la boucle fermée (20, 21), ou d'une combinaison de ces deux effets (11).
(A) Spectre d'absorption ultraviolet/visible/proche infrarouge, dont les pics sont marqués avec leurs pigments correspondants et normalisés par rapport au pic BPh à 775 nm. (B) Spectre de dichroïsme circulaire normalisé par rapport à l'absorbance de la BChl à 805 nm. (C et D) Spectres ΔA sélectionnés à partir des spectres d'absorption résolus en temps des complexes RC-LH114-W (C) et RC-LH116 (D). Pour une meilleure comparabilité, tous les spectres sont normalisés par rapport à ΔA de −A à 0,2 ps. (E) Vitesse d'oxydation du cytochrome c2 après irradiation en présence de différentes concentrations d'UQ2 (voir Figure S8 pour les données brutes). (F) Dans les cellules cultivées sous une lumière de faible, moyenne ou forte intensité (10, 30 ou 300 μM m⁻² s⁻¹, respectivement), proportions des sous-unités protéiques W et RC-L dans le complexe purifié et dans la membrane séparée. Déterminer le niveau de protéine par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS et par dosage immunologique (voir figure S9 pour les données brutes). Déterminer le rapport par rapport au complexe RC-LH114-W purifié. Le rapport stœchiométrique RC-L/protéine W du complexe est de 1:1.
Les BChls en position 1 de la boucle αβ14 déformée de RC-LH114-W (Figure 1, A, C et E) sont plus proches du donneur primaire (P) du centre réactionnel (RC) de 6,8 Å que les BChls équivalents dans RC-LH116 (Figure 1, B, D et F, et Figure S3). Cependant, la cinétique d'absorption transitoire des deux complexes montre que, pour RC-LH114-W et RC-LH116, les constantes de temps de transfert d'énergie d'excitation de LH1 vers RC sont respectivement de 40 ± 4 ps et 44 ± 3 ps (Figure 2, C et D, Figure S4 et Tableau S2). Aucune différence significative n'est observée au niveau du transfert électronique au sein du RC (Figure S5 et texte supplémentaire associé). Nous supposons que la forte similitude des temps de transfert d'énergie entre LH1 et RC-P est due à la similarité de distance, d'angle et d'énergie potentielle de la plupart des BChls dans les deux boucles LH1. Il semble que l'exploration du profil énergétique de LH1 pour atteindre la distance minimale ne soit pas plus rapide que le transfert direct d'énergie depuis des sites sous-optimaux vers RC. La boucle ouverte LH1 dans RC-LH114-W pourrait également subir une agitation thermique négligeable à basse température lors de l'analyse structurale, et la conformation de l'anneau αβ14 est plus longue à température ambiante, du fait de la distance de pigmentation des βBChls au niveau de RC 1.
Le complexe RC-LH116 contient 32 BChls et 16 caroténoïdes, et son organisation générale est identique à celle obtenue chez *Thermochromatium (Tch.) pidpidum* [identifiant PDB 5Y5S] (9), *Thiorhodovibrio (Trv.)* souche 970 (identifiant PDB 7C9R) (12) et l'algue verte *Blc. viridis* (identifiant PDB 6ET5) (10). Après alignement, seules de légères variations de position des hétérodimères αβ ont été observées, notamment pour les liaisons 1 à 5, 15 et 16 (Figure S6). La présence de la protéine W influence significativement la structure de LH1. Ses trois domaines transmembranaires (TMH) sont reliés par de courtes boucles, l'extrémité N-terminale se trouvant du côté luminal du complexe et l'extrémité C-terminale du côté cytoplasmique (Figures 1A et 3, A à D). La protéine W est majoritairement hydrophobe (Figure 3B), et les domaines transmembranaires TMH2 et TMH3 interagissent avec LH1αβ-14 pour former une surface transmembranaire (Figure 3, B et E à G). L'interface est principalement composée de résidus Phe, Leu et Val dans la région transmembranaire. Ces résidus sont associés à des acides aminés hydrophobes et aux pigments αβ-14. Certains résidus polaires contribuent également à l'interaction, notamment la liaison hydrogène entre W-Thr68 et β-Trp42 à la surface de la cavité du complexe (Figure 3, F et G). À la surface du cytoplasme, Gln34 est adjacent au groupe cétone des caroténoïdes αβ-14. De plus, la molécule de n-dodécyl β-D-maltoside (β-DDM) a été résolue, et sa queue hydrophobe s'étend jusqu'à l'interface entre la protéine W et αβ-14, tandis que sa queue lipidique pourrait être localisée à l'intérieur de la protéine. Nous avons également observé que les régions C-terminales résolues des protéines W et RCH sont très proches, sans toutefois permettre la formation d'interactions spécifiques (Figure 1, A et E). Cependant, des interactions au niveau des acides aminés C-terminaux non résolus de ces deux protéines pourraient exister, ce qui constituerait un mécanisme de recrutement de la protéine W lors de l'assemblage du complexe RC-LH114-W.
(A) La protéine W, représentée schématiquement à l'interface avec LH1αβ14, possède une chaîne latérale en forme de bâtonnet (rouge), visible sur une partie du diagramme de potentiel électrostatique (surface grise transparente, niveau de contour 0,13). (B) La protéine W est représentée par une surface hydrophobe colorée. Les zones polaires et chargées sont en cyan, les zones hydrophobes en blanc et les zones fortement hydrophobes en orange. (C et D) La protéine W est représentée schématiquement, son orientation étant identique à celle de (A) (C) et après une rotation de 180° (D). Les résidus distincts sont colorés selon leur position dans la séquence, l'extrémité N-terminale étant bleue et l'extrémité C-terminale rouge. (E) La protéine W est représentée selon la même vue que dans (A), les résidus à l'interface protéine W:LH1 étant représentés par des bâtonnets avec des marques. (F) La protéine W est pivotée de 90° par rapport à (E) et à LH1αβ14 dans la représentation schématique, et par rapport aux résidus d'interface dans la représentation en barres. Les résidus en saillie du polypeptide β sont indiqués. Le cofacteur est représenté par une barre de la même couleur que sur la figure 1, le β-DDM décomposé est représenté en gris et l'oxygène en rouge. (G) La vue de (F) est pivotée de 180°, les résidus proéminents du polypeptide α étant indiqués.
La protéine W remplace un hétérodimère αβ (le 15e sur la figure 1F), empêchant ainsi la fermeture de la boucle et inclinant les trois premiers hétérodimères αβ. L'angle d'inclinaison maximal du premier hétérodimère αβ-1 par rapport à la normale au film est de 25° à 29° (figure 1, A et E), résultant de l'inclinaison de 2° à 8° de αβ-1 dans le complexe RC (contraste net LH116) (figure 1, B et F). Les deuxième et troisième hétérodimères sont inclinés respectivement de 12° à 22° et de 5° à 10°. En raison de l'encombrement stérique du complexe RC, l'inclinaison de αβ-1 n'inclut pas la seconde paire de αβ (correspondant au 16e αβ sur la figure 1F), formant ainsi un espace visible dans l'anneau LH1 (figure 1, A et E). En raison de l'absence de deux hétérodimères αβ, associée à la perte de quatre BChl et de deux caroténoïdes, aucun caroténoïde ne se lie à la sous-unité αβ-1 torsadée, ce qui donne un anneau LH114-W contenant 13 caroténoïdes (dont la chlorophylle végétale) et 28 BChl. Les estimations de résolution locale des deux complexes dans les régions αβ1 à αβ7 sont inférieures à celles du reste de la boucle LH1, ce qui pourrait refléter la plasticité intrinsèque de la sous-unité LH1 adjacente au site QB du centre réactionnel (Figure 4).
Les images des RC-LH114-W (A et B) et RC-LH116 (C et D) sont présentées selon la même vue de dessus/de côté (A et B) et la même surface de cavité que celle de la figure 1 (B et D). La légende colorée est indiquée à droite.
Le seul autre complexe central caractéristique présentant un rapport stœchiométrique de 1:14 est le dimère RC-LH1-PufX de Rhodococcus sphaeroides (Rba.) (13). Cependant, les protéines W et PufX ne présentent aucune homologie évidente et influencent significativement leurs structures LH1 respectives. PufX est un domaine transmembranaire unique doté d'un domaine cytoplasmique N-terminal qui interagit avec la face cytoplasmique de la sous-unité RC-H (13) à une position correspondant à LH116αβ-16 de Rps. palustris. PufX crée un canal pour l'échange quinone/quinolone entre RC-LH1 et le complexe cytochrome bcl et est présent dans tous les complexes centraux de Rba. sphaeroides (13). Bien que l'interface monomère-monomère soit présente chez Rba. Le dimère RC-LH1-PufX de Sphaeroides est situé au niveau du site de liaison de la protéine W dans RC-LH114-W, et l'espace induit par PufX et la protéine W se trouve à une position équivalente (Figure S7A). Cet espace dans RC-LH114-W est également aligné avec le canal à quinone hypothétique (8) de LH1 de Pseudomonas rosea, formé par des peptides non apparentés à la protéine W ni à PufX (Figure S7B). De plus, le canal à quinone de LH1 vert émeraude de Blc., formé par l'exclusion d'une sous-unité γ (7), est situé à une position similaire (Figure S7C). Bien que médiés par différentes protéines, l'apparition de ces canaux à quinone/quinolol à une position commune dans le complexe RC-LH1 semble être un exemple d'évolution convergente, indiquant que l'espace créé par la protéine W pourrait agir comme un canal à quinone.
L'espace dans la boucle LH114-W permet la formation d'une région membranaire continue entre l'espace interne du complexe RC-LH114-W et la membrane principale (Figure 1G), au lieu de connecter les deux domaines par un pore protéique comme c'est le cas pour les protéines. Le complexe RC-LH116 est similaire à un complexe Tch fermé, de type aiguille (22) (Figure 1H). La diffusion de la quinone à travers la membrane étant plus rapide que sa diffusion à travers le canal protéique étroit, la boucle LH114-W ouverte permet un renouvellement du centre réactionnel (CR) plus rapide que la boucle LH116 fermée, et la diffusion de la quinone dans le CR peut être plus restreinte. Afin de déterminer si la protéine W influence la conversion des quinones par le CR, nous avons réalisé un test d'oxydation du cytochrome sur une certaine concentration d'ubiquinone 2 (UQ2) (un analogue de l'UQ10 naturelle avec une chaîne isoprène plus courte) (Figure 2E). Bien que la présence de quinone chélatée entrave la détermination précise de la constante de Michaelis apparente (RC-LH114-W et RC-LH116 conviennent respectivement à 0,2±0,1μM et 0,5±0,2μM), la vitesse maximale de RC-LH114-W (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) est 28±5% supérieure à celle de RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Nous avons initialement estimé que la protéine W est présente dans environ 10 % du complexe central (16) ; ici, les taux d’occupation des cellules cultivées en faible, moyenne et forte luminosité sont respectivement de 15 ± 0,6 %, 11 ± 1 % et 0,9 ± 0,5 % (Figure 2F). Une comparaison quantitative par spectrométrie de masse a montré que l’ajout d’une étiquette histidine ne réduisait pas l’abondance relative de la protéine W par rapport aux souches sauvages (P = 0,59), ce qui indique que ces niveaux ne sont pas un artefact dû à une protéine W modifiée (Figure S10). Cependant, cette faible occupation de la protéine W dans le complexe RC-LH1 pourrait permettre à certains RC de basculer plus rapidement, atténuant ainsi l’échange quinone/quinolone plus lent dans le complexe RC-LH116. Nous avons constaté que le taux d’occupation élevé en forte luminosité est incohérent avec les données transcriptomiques récentes, qui indiquent que l’expression du gène pufW augmente sous forte luminosité (Figure S11) (23). La différence entre la transcription de pufW et l'incorporation de la protéine W dans le complexe RC-LH1 est source de confusion et pourrait refléter la régulation complexe de cette protéine.
Dans RC-LH114-W, 6 molécules de cardiolipine (CDL), 7 de phosphatidylcholine (POPC), 1 de phosphatidylglycérol (POPG) et 29 de β-DDM sont identifiées et modélisées. RC-LH116 (Figure 5, A et B). Dans ces deux structures, la CDL est majoritairement située du côté cytoplasmique du complexe, tandis que la POPC, la POPG et la β-DDM sont principalement localisées du côté luminal. Deux molécules de lipides et deux molécules de détergent ont été isolées dans la région αβ-1 à αβ-6 du complexe RC-LH114-W (Figure 5A), et cinq dans la région équivalente de RC-LH116 (Figure 5B). Davantage de lipides ont été observés de l'autre côté du complexe, principalement du CDL, accumulés entre RC et αβ-7 à αβ-13 (Figure 5, A et B). D'autres lipides et détergents, dont la structure a été résolue, sont situés à l'extérieur de l'anneau LH1. Des chaînes acyles bien résolues s'étendent entre les sous-unités LH1, provisoirement désignées comme β-DDM dans RC-LH114-W et définies comme β-DDM dans RC. Un mélange de β-DDM et de POPC-LH116. La similarité des positions des lipides chélateurs et des détergents dans notre structure indique qu'il s'agit de sites de liaison physiologiquement pertinents (Figure S12A). Les positions des molécules équivalentes dans Tch présentent également une bonne cohérence. Gentle et Trv. La souche 970 RC-LH1s (Figure S12, B à E) (9, 12) et les résidus de liaison hydrogène du groupe de tête lipidique ont montré une assez bonne conservation dans l'alignement de séquence (Figure S13), indiquant que le CDL conservé qui se lie au RC (24), ces sites peuvent être conservés dans le complexe RC-LH1.
(A et B) Les peptides RC-LH114-W (A) et RC-LH116 (B) sont représentés par des schémas, et les pigments par des bâtonnets, selon le code couleur de la figure 1. Les lipides sont représentés en rouge et les détergents en gris. L'UQ lié aux sites RC QA et QB est jaune, tandis que l'UQ isolé est bleu. (C et D) Vues identiques à (A) et (B), sans les lipides. (E à G) Vue agrandie de Q1 (E), Q2 (F) et Q3 (G) de RC-LH116, montrant les chaînes latérales interagissant entre elles. Les liaisons hydrogène sont représentées par des pointillés noirs.
Dans RC-LH116, les quinones RC QA et QB UQ, impliquées dans le transfert d'électrons lors de la séparation de charges, sont décomposées au niveau de leurs sites de liaison. Cependant, dans RC-LH114-W, la quinone QB n'a pas été résolue et sera discutée en détail ci-dessous. Outre les quinones QA et QB, deux molécules d'UQ chélatées (situées entre les cycles RC et LH1) sont identifiées dans la structure de RC-LH114-W grâce à leurs groupements de tête bien résolus (situés respectivement dans Q1 et Q2). (Figure 5C). Deux unités isoprènes sont attribuées à Q1, et la carte de densité électronique résout l'intégralité des 10 chaînes isoprènes de Q2. Dans la structure de RC-LH116, trois molécules d'UQ10 chélatées (Q1 à Q3, Figure 5D) ont été résolues, et toutes les molécules présentent une densité électronique nette sur toute leur longueur (Figure 5, D à G). Dans les deux structures, les positions des groupements quinones de Q1 et Q2 sont parfaitement cohérentes (Figure S12F), et ils interagissent uniquement avec RC. Q1 est situé à l'entrée de l'espace W de RC-LH114-W (Figures 1G et 5C, D et E), et Q2 est situé près du site de liaison de QB (Figures 5C, D et F). Les résidus conservés L-Trp143 et L-Trp269 sont très proches de Q1 et Q2 et offrent des interactions π-π potentielles (Figures 5E et F, et Figure S12). L-Gln88, à 3,0 Å de l'oxygène distal de Q1, forme une forte liaison hydrogène (Figure 5E) ; ce résidu est conservé dans tous les RC, à l'exception du plus éloigné (Figure S13). La L-Ser91 est substituée de manière conservative par la Thr dans la plupart des autres RC (Figure S13), se situe à 3,8 Å de l'oxygène méthyle de Q1 et pourrait former des liaisons hydrogène faibles (Figure 5E). Q3 ne semble pas interagir spécifiquement, mais se trouve dans la région hydrophobe entre la sous-unité RC-M et la sous-unité LH1-α 5 à 6 (Figure 5, D et G). Les quinones Q1, Q2 et Q3, ou des quinones chélatées à proximité, ont également été résolues chez Tch. Gentle, Trv. souche 970 et Blc. La structure de l'iris (9, 10, 12) indique un site de liaison de quinone auxiliaire conservé dans le complexe RC-LH1 (Figure S12G). Les cinq UQ décomposés dans RC-LH116 sont en bon accord avec les 5,8±0,7 de chaque complexe déterminés par chromatographie liquide à haute performance (HPLC), tandis que les trois UQ décomposés dans RC-LH114-W sont inférieurs à la valeur mesurée de 6,2±0,3 (Fig. S14) indique qu'il existe des molécules d'UQ non résolues dans la structure.
Les polypeptides L et M pseudo-symétriques contiennent chacun cinq TMH et forment un hétérodimère combinant un dimère de BChl, deux monomères de BChl, deux monomères de bactériophage (BPh), un atome de fer non héminique et une ou deux molécules d'UQ10. Grâce à la présence de liaisons hydrogène sur le groupe cétone terminal et à son accumulation connue chez Rps, les caroténoïdes sont incorporés dans la sous-unité M, nommée cis-3,4-déshydroorhodopine. Espèce (25). Le domaine membranaire externe de RC-H est ancré à la membrane par un seul TMH. La structure globale du RC est similaire à celle du RC à trois sous-unités d'espèces apparentées (telles que Rba). sphaeroides (PDB ID : 3I4D). Les macrocycles de BChl et BPh, le squelette caroténoïde et le fer non héminique se chevauchent dans la plage de résolution de ces structures, tout comme le groupe de tête UQ10 au site QA et la quinone QB au RC-LH116 (Figure S15).
La disponibilité de deux structures RC présentant des taux d'occupation différents des sites QB offre une nouvelle opportunité d'examiner les changements conformationnels cohérents accompagnant la liaison de la quinone QB. Dans le complexe RC-LH116, la quinone QB est située en position « proximale » (26), correspondant à la liaison complète. En revanche, la structure séparée de RC-LH114-W ne présente pas de quinone QB. Cette absence est surprenante, car le complexe est actif, plus encore que le complexe RC-LH116 dont la quinone QB est structurellement résolue. Bien que les deux anneaux LH1 chélatent environ six quinones, cinq sont structurellement résolues dans l'anneau fermé de RC-LH116, tandis que seulement trois le sont dans l'anneau ouvert de RC-LH114-W. Ce désordre structural accru pourrait refléter un remplacement plus rapide des sites QB de RC-LH114-W, une cinétique de la quinone plus rapide au sein du complexe et une probabilité accrue de franchissement de la boucle LH1. Nous suggérons que l'absence d'UQ dans le site QB du RC-LH114-W pourrait être le résultat d'un complexe plus complexe et plus actif, et que le site QB du RC-LH114-W a été immédiatement bloqué dans le renouvellement de l'UQ. L'étape spécifique (l'entrée du site QB a été fermée) reflète la conformation de cette activité.
En l'absence de QB, la rotation concomitante de L-Phe217 vers une position incompatible avec la liaison de l'UQ10 provoque une collision spatiale avec le premier motif isoprène de la queue (Figure 6A). De plus, les principaux changements conformationnels sont manifestes, notamment au niveau de l'hélice de (courte hélice dans la boucle entre TMH D et E), où L-Phe217 se déplace vers la poche de liaison de QB, et de la rotation de L-Tyr223 (Figure 6A) afin de rompre la liaison hydrogène avec le squelette de M-Asp45 et de fermer l'entrée du site de liaison de QB (Figure 6B). L'hélice de pivote à sa base, le Cα de L-Ser209 est déplacé de 0,33 Å, tandis que celui de L-Val221 est déplacé de 3,52 Å. Aucun changement n'est observable au niveau de TMH D et E, qui sont superposables dans les deux structures (Figure 6A). À notre connaissance, il s'agit de la première structure du centre réactionnel naturel qui ferme le site QB. Une comparaison avec la structure complète (liée à QB) montre qu'avant la réduction de la quinone, un changement conformationnel est nécessaire pour permettre son insertion. Le résidu L-Phe217 pivote pour former une interaction π-π avec le groupement polaire de la quinone, et l'hélice se déplace vers l'extérieur, permettant au squelette de L-Gly222 et à la chaîne latérale de L-Tyr223 de former un réseau de liaisons hydrogène stable (Figure 6, A et C).
(A) Représentation schématique superposée de l'hologramme (chaîne L, orange/chaîne M, magenta) et de la structure apo (grise), où les résidus clés sont représentés sous forme de bâtonnets. UQ10 est représenté par une barre jaune. La ligne pointillée indique les liaisons hydrogène formées dans la structure. (B et C) Représentation de la surface de l'apolipoprotéine et de la structure cyclique complète, mettant en évidence l'oxygène de la chaîne latérale de L-Phe217 en bleu et de L-Tyr223 en rouge. La sous-unité L est orange ; les sous-unités M et H ne sont pas colorées. (D et E) Sites QB du complexe réactionnel (RC) de l'apolipoprotéine (D) et de l'ensemble du RC (E) [colorés respectivement par (A)] et PSII de Thermophilus thermophilus (vert, bleu avec quinone plastique ; identifiant PDB : 3WU2). Alignement (58).
De façon inattendue, bien que plusieurs structures de centres réactionnels (CR) déficients en QB et dépourvus de LH1 soient disponibles, les changements conformationnels observés dans cette étude n'avaient pas été rapportés auparavant. Parmi ces structures figurent celles de Blc. viridis (PDB ID : 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID : 1EYS) (28) et Rba. sphaeroides (PDB ID : 1OGV) (29), dépourvues de QB, et dont la structure globale est presque identique à celle de leurs CR. L'examen attentif de 3PRC a révélé que les molécules de détergent LDAO (oxyde de lauryldiméthylamine) se lient à l'entrée du site QB, ce qui pourrait empêcher un réarrangement en une conformation fermée. Bien que le LDAO ne se décompose pas au même endroit dans 1EYS ou 1OGV, ces CR sont préparés avec le même détergent et pourraient donc produire le même effet. La structure cristalline de Rba. Le centre réactionnel (CR) de Sphaeroides co-cristallisé avec le cytochrome c2 (identifiant PDB : 1L9B) semble également présenter un site QB fermé. Cependant, dans ce cas, la région N-terminale du polypeptide M du CR (interagissant avec le site de liaison QB via la liaison hydrogène du résidu Tyr de l’hélice Q) adopte une conformation non naturelle, et le changement conformationnel du QB n’est pas étudié plus en détail (30). Il est rassurant de constater que nous n’avons pas observé ce type de déformation du polypeptide M dans la structure du CR-LH114-W, qui est quasiment identique à la région N-terminale du CR-LH116. Il convient également de noter qu’après l’élimination de l’antenne LH1 à base de détergent, les CR des apolipoprotéines de la PDB ont été résolus, ce qui a permis d’éliminer les pools de quinones et les lipides internes présents dans l’espace entre le CR et la surface interne de l’anneau LH1 environnant (31, 32). Le centre réactionnel (CR) reste fonctionnel car il conserve tous ses cofacteurs, à l'exception de la quinone QB décomposable, moins stable et souvent perdue lors de la préparation (33). De plus, il est établi que l'élimination de LH1 et des lipides cycliques naturels du CR peut impacter ses fonctions, notamment en réduisant la durée de vie de l'état P+QB à charges séparées (31, 34, 35). Par conséquent, nous supposons que la présence de l'anneau LH1 local autour du CR maintient le site QB « fermé », préservant ainsi l'environnement local au voisinage du QB.
Bien que l'apolipoprotéine (sans quinone QB) et la structure complète ne représentent que deux instantanés du renouvellement du site QB, et non une série d'événements, certains indices suggèrent que la liaison peut être contrôlée pour empêcher la reliaison par l'hydroquinone et ainsi inhiber l'inhibition par le substrat. L'interaction du quinolol et de la quinone à proximité du site QB de l'apolipoprotéine pourrait différer, ce qui expliquerait son rejet par le centre réactionnel (CR). Il est admis depuis longtemps que les changements conformationnels jouent un rôle dans la liaison et la réduction des quinones. La capacité des CR figés à réduire les quinones après adaptation à l'obscurité est altérée (36) ; la cristallographie aux rayons X montre que cette altération est due au piégeage des quinones QB dans une conformation « distale », à environ 4,5 Å de la position proximale active (26, 37). Nous suggérons que cette conformation de liaison distale représente un instantané de l'état intermédiaire entre l'apolipoprotéine et la structure cyclique complète, après l'interaction initiale avec la quinone et l'ouverture du site QB.
Le centre réactionnel (CR) de type II présent dans le complexe PSII de certaines bactéries et cyanobactéries phototrophes, algues et plantes présente une conservation structurale et fonctionnelle (38). L'alignement structural illustré dans la figure 6 (D et E) souligne la similarité entre les CR du PSII et le site QB du complexe CR bactérien. Cette comparaison sert depuis longtemps de modèle pour l'étude des systèmes étroitement apparentés de liaison et de réduction des quinones. Des publications antérieures suggèrent que des changements conformationnels s'accompagnent de la réduction des quinones par le PSII (39, 40). Par conséquent, compte tenu de la conservation évolutive du CR, ce mécanisme de liaison, jusqu'alors inobservé, pourrait également s'appliquer au site QB du CR du PSII chez les plantes phototrophes oxygénées.
Les souches Rps ΔpufW (délétion du gène pufW non marqué) et PufW-His (protéine W marquée 10x His en C-terminal, exprimée à partir du locus pufW naturel) ont été utilisées. La souche CGA009 de *P. palustris* a été décrite dans notre publication précédente (16). Ces souches, ainsi que la souche sauvage isogénique parentale, ont été décongelées par ensemencement d'un petit nombre de cellules sur gélose PYE (5 g/L chacune) (conservée dans du milieu LB à -80 °C, contenant 50 % (p/v) de glycérol), de protéines, d'extrait de levure et de succinate [1,5 % (p/v)]. La gélose a été incubée une nuit à l'obscurité et à température ambiante en anaérobiose, puis éclairée par une lumière blanche (~50 µmol m⁻² s⁻¹) fournie par des ampoules halogènes OSRAM de 116 W (RS Components, Royaume-Uni) pendant 3 à 5 jours, jusqu'à l'apparition d'une colonie unique. Une colonie isolée a servi à inoculer 10 ml de milieu M22+ (41) supplémenté avec 0,1 % (p/v) d'acides aminés caséiniques (ci-après dénommé M22). La culture a été incubée à l'obscurité, en conditions de faible oxygénation, à 34 °C sous agitation à 180 tr/min pendant 48 heures. 70 ml de cette culture ont ensuite été inoculés dans les mêmes conditions pendant 24 heures. Une culture semi-aérobie de 1 ml a été utilisée pour inoculer 30 ml de milieu M22 dans un flacon en verre transparent de 30 ml à bouchon à vis universel. Le mélange a été incubé sous agitation (~50 μmol m⁻² s⁻¹) pendant 48 heures à l'aide d'un agitateur magnétique stérile. On a ensuite inoculé 30 ml de la culture avec environ 1 litre de culture dans les mêmes conditions, puis utilisé cette culture pour inoculer environ 9 litres de culture illuminée à ~200 μmol m⁻² s⁻¹ pendant 72 heures. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 7132 g pendant 30 minutes, remises en suspension dans environ 10 ml de Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) et conservées à -20 °C jusqu'à utilisation.
Après décongélation, ajouter aux cellules en suspension des cristaux de désoxyribonucléase I (Merck, Royaume-Uni), de lysozyme (Merck, Royaume-Uni) et deux comprimés d'inhibiteur de protéase holoenzymatique Roche (Merck, Royaume-Uni). Les cellules sont lysées 8 à 12 fois dans une cellule de pression française à 20 000 psi (Aminco, États-Unis). Après élimination des cellules intactes et des débris insolubles par centrifugation à 18 500 g pendant 15 minutes à 4 °C, la membrane est précipitée du lysat pigmenté par centrifugation à 113 000 g pendant 2 heures à 43 000 °C. Jeter la fraction soluble et remettre en suspension la membrane colorée dans 100 à 200 ml de Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) et homogénéiser jusqu'à disparition des agrégats visibles. La membrane en suspension a été incubée dans du Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) (Anatrace, États-Unis) contenant 2 % (p/v) de β-DDM pendant 1 heure à l'obscurité et à 4 °C sous agitation douce. Elle a ensuite été centrifugée à 70 °C pendant 150 000 g à 4 °C pendant 1 heure afin d'éliminer les insolubles résiduels.
La membrane solubilisante de la souche ΔpufW a été appliquée sur une colonne d'échange d'ions DEAE Sepharose de 50 ml, préalablement remplie de trois volumes de colonne (VC) de tampon de liaison [Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) contenant 0,03 % (p/v) de β-DDM]. La colonne a été lavée avec deux VC de tampon de liaison, puis avec deux VC de tampon de liaison contenant 50 mM de NaCl. Le complexe RC-LH116 a été élué par un gradient linéaire de 150 à 300 mM de NaCl (dans le tampon de liaison) sur 1,75 VC, et le complexe restant a été élué avec un tampon de liaison contenant 300 mM de NaCl sur 0,5 VC. Collectez le spectre d'absorption entre 250 et 1000 nm, conservez la fraction présentant un rapport d'absorbance (A880/A280) supérieur à 1 entre 880 et 280 nm, diluez-la deux fois dans le tampon de liaison et répétez la procédure sur la colonne DEAE pour la purification. Diluez les fractions présentant des rapports A880/A280 supérieurs à 1,7 et A880/A805 supérieurs à 3,0, effectuez un troisième échange d'ions et conservez les fractions présentant des rapports A880/A280 supérieurs à 2,2 et A880/A805 supérieurs à 5,0. Le complexe partiellement purifié a été concentré à environ 2 ml à l'aide d'un filtre centrifuge Amicon de seuil de coupure de 100 000 Da (Merck, Royaume-Uni), puis déposé sur une colonne d'exclusion stérique Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, États-Unis) contenant un tampon NaCl 200 mM. L'élution a été réalisée avec le même tampon à un volume de 1,5 CV. Les spectres d'absorption de la fraction d'exclusion stérique ont été collectés, puis concentrés à 100 A880 pour des rapports A880/A280 supérieurs à 2,4 et A880/A805 supérieurs à 5,8. Ces spectres ont été immédiatement utilisés pour la préparation des grilles de cryo-TEM ou conservés à -80 °C jusqu'à utilisation.
La membrane de solubilisation de la souche PufW-His a été appliquée sur une colonne HisPrep FF Ni-NTA Sepharose de 20 ml (Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) contenant 200 mM de NaCl et 0,03 % (p/p) de β-DDM dans un tampon IMAC (GE Healthcare). La colonne a été lavée avec cinq volumes de colonne (VC) de tampon IMAC, puis avec cinq VC de tampon IMAC contenant 10 mM d'histidine. Le complexe central a été élué de la colonne avec cinq VC de tampon IMAC contenant 100 mM d'histidine. La fraction contenant le complexe RC-LH114-W a été concentrée à environ 10 ml dans une cuve agitée équipée d'un filtre Amicon 100 000 MWCO (Merck, Royaume-Uni), diluée 20 fois avec un tampon de liaison, puis ajoutée à 25 ml de la colonne DEAE Sepharose. Quatre VC de tampon ont été utilisés au préalable. Laver la colonne avec quatre tampons de liaison CV, puis éluer le complexe sur huit CV selon un gradient linéaire de 0 à 100 mM de NaCl (dans le tampon de liaison), les quatre CV restants contenant 100 mM de tampon de liaison. Les complexes résiduels élués sur le chlorure de sodium, combinés aux fractions présentant un rapport A880/A280 supérieur à 2,4 et un rapport A880/A805 supérieur à 4,6, ont été concentrés à environ 2 ml dans un filtre centrifuge Amicon 100 000 MWCO, puis remplis avec 1,5 CV IMAC au préalable. La colonne d'exclusion stérique Superdex 200 16/600 a été équilibrée avec le tampon, puis éluée dans le même tampon sur 1,5 CV. Collectez les spectres d'absorption des fractions d'exclusion de taille et concentrez les spectres d'absorption avec des rapports A880/A280 supérieurs à 2,1 et des rapports A880/A805 supérieurs à 4,6 à 100 A880, qui sont immédiatement utilisés pour la préparation de grilles TEM congelées ou stockés à -80°C jusqu'à ce qu'ils soient nécessaires.
Un congélateur à immersion Leica EM GP a été utilisé pour préparer les grilles TEM basse température. Le complexe a été dilué dans un tampon IMAC jusqu'à une absorbance de 50 à 880 nm, puis 5 μl ont été déposés sur une grille de cuivre recouverte de carbone QUANTIFOIL 1.2/1.3 (Agar Scientific, Royaume-Uni), préalablement traitée par décharge luminescente. La grille a été incubée à 20 °C et 60 % d'humidité relative pendant 30 s, puis essuyée pendant 3 s, avant d'être refroidie brutalement dans de l'éthane liquide à -176 °C.
Les données du complexe RC-LH114-W ont été enregistrées sur l'eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) à l'aide d'un microscope Titan Krios, fonctionnant sous une tension d'accélération de 300 kV, avec un grossissement nominal de 130 000× et une énergie de 20 eV. Un système Gatan 968 GIF Quantum équipé d'un détecteur K2 Peak a été utilisé pour l'acquisition des images en mode comptage. La taille des pixels calibrés est de 1,048 Å et le débit de dose de 3,83 e-Å⁻² s⁻¹. L'acquisition vidéo a duré 11 secondes et a été divisée en 40 segments. La mise au point du microscope a été effectuée à l'aide d'une lentille de carbone, puis trois séquences ont été acquises par segment. Au total, 3 130 séquences ont été collectées, avec des valeurs de défocalisation comprises entre -1 et -3 µm.
Les données relatives au complexe RC-LH116 ont été collectées à l'aide du même microscope au laboratoire de biostructure d'Asterbury (université de Leeds, Royaume-Uni). L'acquisition a été réalisée en mode comptage avec un grossissement de 130 000 et une taille de pixel calibrée à 1,065 Å pour une dose de 4,6 e-Å⁻² s⁻¹. L'enregistrement vidéo, d'une durée de 12 secondes, a été divisé en 48 segments. Au total, 3 359 séquences ont été collectées, avec des valeurs de défocalisation comprises entre -1 et -3 µm.
Le traitement des données est entièrement réalisé avec le pipeline Relion 3.0 (42). Motioncorr 2 (43) est utilisé pour corriger le mouvement du faisceau par pondération de dose, puis CTFFIND 4.1 (44) pour déterminer le paramètre CTF (fonction de transfert de contraste). Les photomicrographies typiques après ces étapes de traitement initiales sont présentées dans la figure 2.S16. Le modèle de sélection automatique est généré en sélectionnant manuellement environ 250 pixels parmi 1 000 particules dans une image de 250 pixels, sans classification bidimensionnelle (2D) de référence. Les classifications correspondant à une contamination de l'échantillon ou ne présentant aucune caractéristique discernable sont ainsi rejetées. La sélection automatique a ensuite été appliquée à toutes les microphotographies. Le complexe RC-LH114-W comprenait 849 359 particules et le complexe RC-LH116, 476 547 particules. Toutes les particules sélectionnées ont subi deux cycles de classification 2D sans référence. Après chaque cycle, les particules correspondant à la zone de carbone, à une contamination de l'échantillon, à l'absence de caractéristiques évidentes ou à un fort chevauchement ont été rejetées, ce qui a permis de conserver 772 033 particules (90,9 %) et 359 678 particules (75,5 %) pour RC-LH114-W et RC-LH116, respectivement. Le modèle 3D de référence initial a été généré par la méthode de descente de gradient stochastique. À partir de ce modèle, les particules sélectionnées ont été classées en quatre catégories 3D. En utilisant le modèle de chaque catégorie comme référence, un raffinement 3D a été effectué sur les particules de la catégorie la plus importante. Un filtre passe-bas initial de 15 Å a ensuite été appliqué pour couvrir la zone du solvant, 6 pixels de contours adoucis ont été ajoutés, et un post-traitement a été réalisé pour corriger la fonction de transfert de modulation du pic Gatan K2 du détecteur supérieur. Pour l'ensemble de données RC-LH114-W, le modèle initial a été modifié en supprimant la forte densité aux bords du masque (déconnectée de la densité du complexe central dans UCSF Chimera). Les modèles résultants (les résolutions de RC-LH114-W et RC-LH116 sont respectivement de 3,91 et 4,16 Å) servent de référence pour la seconde classification 3D. Les particules utilisées sont regroupées dans la classe 3D initiale et ne présentent pas de forte corrélation avec leur voisinage, ni de chevauchement ou d'absence de caractéristiques structurales évidentes. Après cette seconde classification, la catégorie présentant la plus haute résolution a été sélectionnée [pour RC-LH114-W, une catégorie comprend 377 703 particules (44,5 %) ; pour RC-LH116, il existe deux catégories, totalisant 260 752 particules (54,7 %), ces deux catégories étant identiques uniquement après alignement suite à la rotation initiale, avec une légère différence]. Les particules sélectionnées sont ré-extraites dans une zone de 400 pixels et affinées par un raffinement 3D. Le masque de solvant est généré à l'aide d'un filtre passe-bas initial de 15 Å, d'une expansion de carte de 3 pixels et d'un masque souple de 3 pixels. Après chaque étape, un raffinement CTF par particule, une correction de mouvement par particule et un second cycle de raffinement CTF par particule sont effectués, suivis d'un raffinement 3D, d'un masquage de solvant et d'un post-traitement afin d'affiner la texture résultante. Avec un seuil de FSC (coefficient de corrélation de Fourier) de 0,143, les résolutions des modèles finaux de RC-LH114-W et RC-LH116 sont respectivement de 2,65 Å et 2,80 Å. La courbe FSC du modèle final est présentée dans la figure 2.S17.
Toutes les séquences protéiques ont été téléchargées depuis UniProtKB : LH1-β (PufB ; identifiant UniProt : Q6N9L5) ; LH1-α (PufA ; identifiant UniProt : Q6N9L4) ; RC-L (PufL ; identifiant UniProt : O83005) ; RC-M (PufM ; identifiant UniProt : A0A4Z7) ; RC-H (PufA ; identifiant UniProt : A0A4Z9) ; protéine W (PufW ; identifiant UniProt : Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) a été utilisé pour construire un modèle d’homologie de RC, contenant les séquences protéiques de RC-L, RC-M et RC-H. La structure cristalline de RC de Rba. sphaeroides a servi de matrice (identifiant PDB : 5LSE) (46). Utilisez l'outil « fit map » d'UCSF Chimera pour ajuster le modèle généré à la carte (47), améliorer la structure protéique et ajouter les cofacteurs [4×BChl a (nom du résidu de la bibliothèque de monomères : BCL), 2×BPh a (BPH), un ou deux types d'UQ10 (U10), un atome de fer non héminique (Fe) et une molécule de 3,4-dihydrohexacarbonylcholine (QAK)] à l'aide de Coot (48). La QAK n'étant pas disponible dans la bibliothèque de monomères, elle a été paramétrée avec l'outil eLBOW de PHENIX (49).
Ensuite, la sous-unité LH1 a été construite. Dans un premier temps, l'outil de construction automatique de PHENIX (49) a été utilisé pour construire automatiquement une partie de la séquence LH1 à partir de la carte et des séquences protéiques LH1-α et LH1-β. La sous-unité LH1 la plus complète a été sélectionnée, extraite et chargée dans Coot. Les séquences manquantes ont été ajoutées manuellement, puis la structure entière a été affinée manuellement avant l'ajout de deux molécules de BClsa (BCL) et d'une molécule de spirilloxanthine (CRT) [en fonction de la densité électronique relative (Rps) du complexe LH1 et de la teneur connue en caroténoïdes (17)]. La sous-unité LH1 complète a été copiée et l'outil « Docking Map Tool » d'UCSF Chimera a été utilisé pour l'ancrer dans la zone non modélisée adjacente de la densité électronique de LH1, puis affinée dans Coot. Ce processus a été répété jusqu'à ce que toutes les sous-unités LH1 aient été modélisées. Pour la structure RC-LH114-W, en extrayant la densité non allouée dans Coot, la protéine est segmentée des composants non protéiques restants dans la carte USCF Chimera. L'outil Autobuild est utilisé pour établir le modèle initial, ainsi que la modélisation des sous-unités restantes (protéine-W) dans PHENIX (49). Les séquences manquantes sont ajoutées au modèle résultant dans Coot (48), puis la sous-unité entière est affinée manuellement. La densité non allouée restante correspond à la combinaison de lipides (identifiants de la bibliothèque de monomères PDB : CDL = CDL, POPC = 6PL et POPG = PGT), de détergent β-DDM (LMT) et de molécules d'UQ10 (U10). L'optimisation est effectuée à l'aide de PHENIX (49) et d'une optimisation manuelle dans Coot (48) afin de perfectionner le modèle initial complet jusqu'à ce que les statistiques du modèle et la qualité visuelle de l'ajustement ne puissent plus être améliorées. Enfin, utilisez LocScale (50) pour affiner la carte locale, puis effectuez plusieurs autres cycles de modélisation de la densité non allouée et d'optimisation automatique et manuelle.
Les peptides, cofacteurs et autres lipides et quinones respectifs, intégrés dans leurs densités respectives, sont présentés dans les figures 1 et 2, S18 à S23. Les informations statistiques du modèle final sont présentées dans le tableau S1.
Sauf indication contraire, les spectres d'absorption UV/Vis/NIR ont été collectés sur un spectrophotomètre Cary60 (Agilent, États-Unis) à intervalles de 1 nm de 250 nm à 1000 nm et un temps d'intégration de 0,1 s.
Diluer l'échantillon dans une cuve en quartz de 2 mm de trajet optique jusqu'à une absorbance à 880 nm (A880) de 1, et enregistrer le spectre d'absorption entre 400 et 1000 nm. Les spectres de dichroïsme circulaire ont été enregistrés sur un spectropolarimètre Jasco 810 (Jasco, Japon) par intervalles de 1 nm entre 400 et 950 nm à une vitesse de balayage de 20 nm min⁻¹.
Le coefficient d'extinction molaire est déterminé en diluant le complexe central à une absorbance à 880 nm (A880) d'environ 50. Diluer 10 μl dans 990 μl de tampon de liaison ou de méthanol, et enregistrer immédiatement le spectre d'absorption afin de minimiser la dégradation de la BChl. La teneur en BChl de chaque échantillon de méthanol a été calculée à partir du coefficient d'extinction à 771 nm, soit 54,8 mM⁻¹ cm⁻¹, et le coefficient d'extinction a été déterminé (51). Diviser la concentration de BChl mesurée par 32 (RC-LH114-W) ou 36 (RC-LH116) permet de déterminer la concentration du complexe central, qui est ensuite utilisée pour déterminer le spectre d'absorption du même échantillon enregistré dans le tampon. Trois mesures répétées ont été effectuées pour chaque échantillon, et l'absorbance moyenne du maximum de BChl Qy a été utilisée pour le calcul. Le coefficient d'extinction du RC-LH114-W mesuré à 878 nm est de 3280±140 mM-1 cm-1, tandis que le coefficient d'extinction du RC-LH116 mesuré à 880 nm est de 3800±30 mM-1 cm-1.
L'UQ10 a été quantifiée selon la méthode décrite en (52). Brièvement, une HPLC en phase inverse (RP-HPLC) a été réalisée à l'aide du système HPLC Agilent 1200. Environ 0,02 nmol de RC-LH116 ou RC-LH114-W ont été dissous dans 50 μl d'un mélange méthanol/chloroforme (50/50) contenant 0,02 % (m/v) de chlorure ferrique. L'élution a été effectuée sur une colonne Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm pré-équilibrée, à un débit de 1 ml/min à 40 °C dans un solvant HPLC (méthanol/2-propanol, 80/20), pendant 1 heure. Une élution isocratique a ensuite été réalisée dans ce même solvant afin de suivre l'absorbance à 275 nm (UQ10), 450 nm (caroténoïdes) et 780 nm (BChl) pendant 1 heure. Le pic du chromatogramme à 275 nm à 25,5 minutes a été intégré ; aucun autre composé détectable n'y a été observé. L'aire intégrée a permis de calculer la quantité molaire d'UQ10 extraite, par rapport à la courbe d'étalonnage établie à partir de l'injection d'étalons purs de 0 à 5,8 nmol (Figure S14). Chaque échantillon a été analysé en trois exemplaires, et l'erreur indiquée correspond à l'écart-type de la moyenne.
Une solution contenant le complexe RC-LH1, présentant une absorption Qy maximale de 0,1, a été préparée avec 30 μM de cytochrome c2 de cœur de cheval réduit (Merck, Royaume-Uni) et de 0 à 50 μM d'UQ2 (Merck, Royaume-Uni). Trois échantillons de 1 ml ont été préparés pour chaque concentration d'UQ2 et incubés une nuit à l'obscurité à 4 °C afin d'assurer une adaptation complète à l'obscurité avant la mesure. La solution a été introduite dans un spectrophotomètre modulaire OLIS RSM1000 équipé d'un réseau de diffraction à flamme de 300 nm/500 traits, et de fentes d'entrée de 1,24 mm, de fente centrale de 0,12 mm et de fente de sortie de 0,6 mm. Un filtre passe-haut de 600 nm a été placé à l'entrée du tube photomultiplicateur de l'échantillon et du tube photomultiplicateur de référence afin d'éliminer la lumière d'excitation. L'absorbance a été mesurée à 550 nm avec un temps d'intégration de 0,15 s. La lumière d'excitation est émise par une LED M880F2 (diode électroluminescente) de 880 nm (Thorlabs Ltd., Royaume-Uni) via un câble à fibre optique à 90 % d'intensité, grâce à un contrôleur DC2200 (Thorlabs Ltd., Royaume-Uni), et est dirigée vers la source lumineuse à un angle de 90°. Le faisceau de mesure est opposé à un miroir afin de renvoyer la lumière non absorbée initialement par l'échantillon. L'absorbance est mesurée 10 s avant l'illumination, qui dure 50 s. Elle est ensuite mesurée pendant 60 s supplémentaires à l'obscurité afin d'évaluer dans quelle mesure le quinolol réduit spontanément le cytochrome c23+ (voir figure S8 pour les données brutes).
Les données ont été traitées en ajustant une vitesse initiale linéaire entre 0,5 et 10 s (selon la concentration d'UQ2) et en calculant la moyenne des vitesses des trois échantillons pour chaque concentration d'UQ2. La concentration de RC-LH1, calculée à partir du coefficient d'extinction correspondant, a permis de convertir la vitesse en efficacité catalytique, représentée graphiquement avec Origin Pro 2019 (OriginLab, États-Unis), et ajustée au modèle de Michaelis-Menten afin de déterminer les valeurs apparentes de Km et Kcat.
Pour les mesures d'absorption transitoire, l'échantillon RC-LH1 a été dilué à environ 2 μM dans un tampon IMAC contenant 50 mM d'ascorbate de sodium (Merck, États-Unis) et 0,4 mM de terbutine (Merck, États-Unis). L'acide ascorbique est utilisé comme donneur d'électrons sacrificiel et le tert-butaclofène comme inhibiteur de QB afin de garantir que le donneur principal du centre réactionnel reste réduit (c'est-à-dire non photo-oxydé) tout au long de la mesure. Environ 3 ml d'échantillon sont introduits dans une cellule rotative sur mesure (environ 0,1 m de diamètre, 350 tr/min) avec une longueur de trajet optique de 2 mm, afin de permettre à l'échantillon, placé sur le trajet du laser, de s'adapter à l'obscurité entre les impulsions d'excitation. Des impulsions laser d'environ 100 fs sont utilisées pour amplifier le système laser Ti:Saphir (Spectra Physics, États-Unis) et exciter l'échantillon à 880 nm à une fréquence de répétition de 1 kHz (20 nJ pour le proche infrarouge ou 100 nJ pour le visible). Avant la collecte des données, exposez l'échantillon à la lumière d'excitation pendant environ 30 minutes. Cette exposition entraînera l'inactivation de l'activité QA (pouvant être réduite une ou deux fois). Notez toutefois que ce processus est réversible : après une longue période d'adaptation à l'obscurité, l'activité QA du centre réactionnel (RC) se rétablira progressivement. Un spectromètre Helios (Ultrafast Systems, États-Unis) a été utilisé pour mesurer les spectres transitoires avec un temps de retard de -10 à 7 000 ps. Utilisez le logiciel Surface Xplorer (Ultrafast Systems, États-Unis) pour dissocier les ensembles de données, puis les fusionner et les normaliser. Utilisez le logiciel CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituanie) pour exploiter l'ensemble de données combiné afin d'obtenir les spectres différentiels liés à la décroissance, ou utilisez une fonction de convolution de plusieurs exposants avec la réponse instrumentale pour ajuster l'évolution spectrale à une seule longueur d'onde dans Origin (OriginLab, États-Unis).
Comme mentionné précédemment (53), un film photosynthétique contenant le complexe LH1, dépourvu de centre réactionnel (RC) et d'antenne périphérique LH2, a été préparé. La membrane a été diluée dans du Tris 20 mM (pH 8,0) puis placée dans une cuvette en quartz de 2 mm de trajet optique. Une impulsion laser de 30 nJ a été utilisée pour exciter l'échantillon à 540 nm, avec un délai de -10 à 7000 ps. Les données ont été traitées selon la méthode décrite pour l'échantillon Rps. pal.
La membrane a été pelletée par centrifugation à 150 000 g pendant 2 heures à 4 °C, puis son absorbance à 880 nm a été mesurée et remise en suspension dans du Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) et du NaCl 200 mM. La membrane a été dissoute par agitation lente dans du β-DDM à 2 % (p/v) pendant 1 heure à l’obscurité et à 4 °C. L’échantillon a été dilué dans du carbonate de triéthylammonium 100 mM (pH 8,0) (TEAB ; Merck, Royaume-Uni) à une concentration protéique de 2,5 mg/ml (analyse Bio-Rad). Le traitement ultérieur a été réalisé selon la méthode précédemment publiée (54), en commençant par la dilution de 50 µg de protéines dans un volume total de 50 µl de TEAB contenant 1 % (p/v) de laurate de sodium (Merck, Royaume-Uni). Après une sonication de 60 s, la solution a été réduite avec 5 mM de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (Merck, Royaume-Uni) à 37 °C pendant 30 minutes. Pour la S-alkylation, l'échantillon a été incubé avec 10 mM de S-méthylthiométhanesulfonate de méthyle (Merck, Royaume-Uni), ajouté à partir d'une solution mère à 200 mM dans l'isopropanol, pendant 10 minutes à température ambiante. La digestion protéolytique a été réalisée par addition de 2 μg d'un mélange trypsine/endoprotéinase Lys-C (Promega, Royaume-Uni) et incubation à 37 °C pendant 3 heures. Le tensioactif laurate a été extrait par addition de 50 μl d'acétate d'éthyle et de 10 μl d'acide trifluoroacétique (TFA) à 10 % (v/v) de qualité LC (Thermo Fisher Scientific, Royaume-Uni), suivie d'une agitation au vortex pendant 60 s. La séparation de phases a été induite par centrifugation à 15 700 g pendant 5 minutes. Conformément au protocole du fabricant, une colonne de centrifugation C18 (Thermo Fisher Scientific, Royaume-Uni) a été utilisée pour aspirer et dessaler soigneusement la phase inférieure contenant le peptide. Après séchage par centrifugation sous vide, l’échantillon a été dissous dans une solution contenant 0,5 % d’acide trifluoroacétique (TFA) et 3 % d’acétonitrile, et 500 ng ont été analysés par chromatographie en phase inverse à nanoflux couplée à la spectrométrie de masse, en utilisant les paramètres système décrits précédemment.
Utilisez MaxQuant v.1.5.3.30 (56) pour l'identification et la quantification des protéines afin d'effectuer une recherche dans la base de données du protéome de Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Les données de protéomique par spectrométrie de masse ont été déposées auprès de l'alliance ProteomeXchange via le dépôt partenaire PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) sous l'identifiant PXD020402.
Pour l'analyse par CLHP-MS, le complexe RC-LH1 a été préparé à partir de la protéine Rps de type sauvage. Selon la méthode précédemment publiée (16), la concentration protéique produite dans les cellules de *Palustris palustris* était de 2 mg ml⁻¹ dans un tampon Hepes 20 mM (pH 7,8), NaCl 100 mM et β-DDM à 0,03 % (p/v) (analyse Bio-Rad). Conformément au protocole du fabricant, 10 µg de protéine ont été extraits par précipitation à l'aide du kit de purification 2D (GE Healthcare, États-Unis), puis le précipité a été dissous dans 20 µl d'un mélange d'acide formique (AF) à 60 % (v/v), d'acétonitrile (20 % v/v) et d'eau (20 % v/v). Cinq microlitres de cette solution ont été analysés par CLHP-MS (Dionex RSLC) couplée à la spectrométrie de masse (Maxis UHR-TOF, Bruker). Utilisez une colonne MabPac 1,2 × 100 mm (Thermo Fisher Scientific, Royaume-Uni) pour la séparation à 60 °C et 100 µl/min, avec un gradient de 85 % (v/v) de solvant A [solution aqueuse de 0,1 % (v/v) d'acide formique et 0,02 % (v/v) d'acide trifluoroacétique] à 85 % (v/v) de solvant B [0,1 % (v/v) d'acide formique et 0,02 % (v/v) d'acide trifluoroacétique dans 90 % (v/v) d'acétonitrile]. En utilisant une source d'ionisation par électrospray standard et les paramètres par défaut pendant plus de 60 minutes, le spectromètre de masse acquiert des spectres de masse de 100 à 2750 m/z (rapport masse/charge). À l'aide de l'outil FindPept du portail de ressources bioinformatiques ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), associez le spectre de masse aux sous-unités du complexe.
Les cellules ont été cultivées pendant 72 heures sous 100 ml de milieu M22 (milieu M22 sans sulfate d'ammonium et remplacé par de l'acétate de sodium) dans un flacon à vis de 100 ml (23). Ce milieu était composé de 100 ml de milieu M22 sans sulfate d'ammonium et sans succinate de sodium. Cinq cycles de 30 secondes ont été effectués avec des billes de verre de 0,1 µm (ratio volumique 1:1) pour lyser les cellules, puis le mélange a été refroidi sur glace pendant 5 minutes. Les matières insolubles, les cellules intactes et les billes de verre ont été éliminés par centrifugation à 16 000 g pendant 10 minutes dans une microcentrifugeuse de paillasse. La membrane a été séparée dans un rotor Ti 70.1 avec 100 000 RCF dans du tris-HCl 20 mM (pH 8,0) avec un gradient de saccharose 40/15 % (p/p) pendant 10 heures.
Comme décrit dans nos travaux précédents, l'immunodétection de l'étiquette His sur PufW (16) a été réalisée. Brièvement, le complexe central purifié (11,8 nM) ou la membrane contenant la même concentration de RC (déterminée par oxydation, après soustraction du spectre de différence réduit et ajustement de la charge sur le gel coloré) a été dilué deux fois dans un tampon de charge SDS 2x (Merck, Royaume-Uni). Les protéines ont été séparées sur un gel NuPage bis-tris 12 % (Thermo Fisher Scientific, Royaume-Uni). Un gel a été coloré au bleu de Coomassie brillant (Bio-Rad, Royaume-Uni) pour charger et visualiser la sous-unité RC-L. Les protéines du second gel ont été transférées sur une membrane de polyfluorure de vinylidène (PVDF) activée au méthanol (Thermo Fisher Scientific, Royaume-Uni) pour le dosage immunologique. La membrane PVDF a été bloquée dans du tris-HCl 50 mM (pH 7,6), du NaCl 150 mM, du Tween-20 à 0,2 % (v/v) et du lait écrémé en poudre à 5 % (p/v), puis incubée avec l'anticorps primaire anti-His (dilué dans le tampon d'anticorps [tris-HCl 50 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM et Tween-20 à 0,05 % (v/v)] à 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, États-Unis) pendant 4 heures. Après 3 lavages de 5 minutes dans un tampon d'anticorps, la membrane a été combinée avec un anticorps secondaire anti-souris conjugué à la peroxydase de raifort (Sigma-Aldrich, Royaume-Uni) (dilué à 1:10 000 dans un tampon d'anticorps). Incuber pour permettre la détection (5 minutes après 3 lavages dans un tampon d'anticorps) à l'aide du substrat de chimiluminescence WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Italie) et de l'Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Royaume-Uni).
En traçant la distribution d'intensité de chaque gel coloré ou piste d'immunoessai, en intégrant l'aire sous le pic et en calculant le rapport d'intensité entre RC-L (gel coloré) et la protéine W (immunoessai), à l'aide d'ImageJ (57), on traite l'image. Ces rapports ont été convertis en rapports molaires en supposant que le rapport RC-L/protéine W dans l'échantillon pur RC-LH114-W était de 1:1 et en normalisant l'ensemble des données en conséquence.
Pour consulter les documents complémentaires relatifs à cet article, veuillez vous rendre à l'adresse suivante : http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Cet article est en libre accès et distribué selon les termes de la licence Creative Commons Attribution. Il autorise l’utilisation, la distribution et la reproduction sans restriction sur tout support, à condition que l’œuvre originale soit correctement citée.
Remarque : Nous vous demandons uniquement votre adresse courriel afin que la personne à qui vous recommandez la page sache que vous souhaitez qu’elle voie ce courriel et qu’il ne s’agit pas d’un pourriel. Nous ne conservons aucune adresse courriel.
Cette question sert à vérifier que vous êtes un visiteur et à empêcher l'envoi automatique de spam.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
La structure à haute résolution du complexe de piège à lumière 1 dans le centre réactionnel apporte de nouvelles perspectives sur la dynamique de la quinone.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
La structure à haute résolution du complexe de piège à lumière 1 dans le centre réactionnel apporte de nouvelles perspectives sur la dynamique de la quinone.
©2021 Association américaine pour l'avancement de la science. tous droits réservés. AAAS est partenaire de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef et COUNTER. Avances scientifiques ISSN 2375-2548.